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小嫩瓜

木虫 (小有名气)

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[求助] 基因组提取过程中加入溶菌酶有白色沉淀

细菌基因组提取加入溶菌酶后产生白色沉淀试剂盒说明书要求37度水浴30-60min,我都水浴了三个小时了还是没啥动静？求原因

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-29 at 11:43 ]

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活的艰辛是因为执着和不放弃

1楼 2011-09-24 17:53:10

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shuixian2009

木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小嫩瓜(金币+1): 2011-09-29 10:56:00
dhd997(金币+5): good 2011-09-29 15:12:07
西瓜(MolEPI+1): 这个可以有~ 2011-09-29 18:33:21

我提基因组时用的试剂盒是OMEGA的，酶的缓冲液是自己配的TE缓冲液，溶菌酶的浓度是5mg/ml,时间一般是30-60min。这是之前的实验步骤：
1．室温下，转移≤3 mL培养液于1.5 mL干净离心管，4000 rpm离心10 min收集细菌；
2．尽量倒去培养基，加入180 μL TE缓冲液完全悬浮细菌，再加入20μL 50 mg/mL溶菌酶混匀后放于30 ℃孵育30 min；
3．室温下以4000 rpm离心5 min收集已消化细胞壁的细菌，弃上清；
4．加入200 μL BTL溶液重悬细胞，革兰氏阳性菌，加入25～40 mg玻璃珠，涡旋5 min，以使细胞壁充分裂解；
5. 加25 μL蛋白酶K（15mg/mL），涡旋混匀，于55 ℃恒温水浴锅中孵育至细菌完全裂解，每20~30 min涡旋振荡样品一次，一般在1小时之内就可消化完全；
6．加入5 μL RNA酶，并在室温下放置5 min；
7．加入220 μL BDL，涡旋混匀，并在65 ℃下水浴10 min；
8．加入220 μL无水乙醇并充分地涡旋振荡；
9．将Hibind柱置于2 mL收集管上,将第8步得到的样品（包括可能形成的所有沉淀）全部转移到柱子内，10,000 rpm离心1 min以结合DNA，弃去流出液和收集管；
10．把柱子装到一新的2 mL收集管上，加入500 μL HB，10,000 rpm离心1 min，弃过滤液；
11．加入750 μL DNA Wash Buffer（已用无水乙醇稀释）于柱子中，10,000 rpm离心1 min以洗涤柱子，弃去流出液，收集管再继续下一步使用；
12．柱子重新套回2 mL收集管，加入750 μL DNA Wash Buffer，10,000 rpm离心1 min以洗涤柱子，弃去流出液。柱子重新套回2 mL收集管，≥10,000 rpm离心空柱2 min以甩干柱子；
13．把柱子置于新的1.5 mL离心管中，加入60 μL 65 ℃预热的DNA Elution Buffer至柱子的膜中央，65 ℃下放置1 min；
14．室温下，10,000 rpm离心1 min从柱子上洗脱出DNA。另取60 μL预热的 DNA Elution Buffer再洗脱一次。加入洗脱液后，将柱子放置于65 ℃，水浴1~2分钟，10,000 rpm离心1 min。离心管内即为提取的基因组DNA，保存在-20 ℃以防止降解；
15．DNA的产量及纯度由紫外分光光度计检测，将提取的DNA取少量做适当稀释，用双蒸水作空白对照，通过比较在260 nm和280 nm处的吸光度估计得到DNA的质量。