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棒哈哈

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[求助] 基因组DNA提取问题

大家好，我是做真菌研究的，在提取基因组DNA时遇到一个问题，能力有限，实在是解决不了，可是实验不能等啊，请有经验，有能力的虫友帮我解决一下，谢谢了！！
我是用液氮研磨菌丝，氯化苄法提取的DNA，提取完之后用200 uL TE buffer溶解（完全溶解）然后用10 uLRNA酶消化过夜，结果跑电泳（见图一），然后我又用TE buffer 稀释5倍后，再跑电泳，结果（见图二），后面加大了RNA酶的量，还是同样出现这种情况，无语了，请问这是为什么？
我的问题是：DNA用TE 完全溶解后（肉眼观察是完全溶解了的）跑电泳，上面没有目的条带，下面有一团亮带，再用TE稀释5倍后，结果上面出现了很明显的目的条带，下面就基本上没有了，请问这是为什么？？

图一

图二

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-14 at 11:33 ]

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1楼2011-12-13 10:52:30

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棒哈哈

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西瓜: 回帖置顶 2011-12-13 19:01:04

不好意思，我表达能力太差了！
我的问题是：DNA用TE 完全溶解后（肉眼观察是完全溶解了的）跑电泳，上面没有目的条带，下面有一团亮带，再用TE稀释5倍后，结果上面出现了很明显的目的条带，下面就基本上没有了，请问这是为什么？？

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4楼2011-12-13 17:40:44

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foreverjohn

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我提取时刚开始也出现过这样的问题，我觉得（1）尽量不要使用对数生长期的细胞，这时候RNA含量较多。（2）液氮研磨确实能很好地防止降解，个人觉得DNase比较脆弱，并且其活性需要二价阳离子，所以在提取DNA时一般要加入EDTA，因此在加入足量的EDTA（10-50mM）条件下，DNA一般不会降解（个人体会），所以提取过程其实没必要保持很低温度，相反较高的温度可以降解掉RNA，对你的提取有利，但是尽量减少剪切，振荡温和点，枪头剪掉前面部分等。（3）RNase可以在研磨时就加进去，增加消化的时间，沉淀溶解时，不要太浓，体系可以大一点，加入RNase酶消化，效果比较好，消化时可以使用50度，一般半小时以内就可以消化殆尽，这时可以再用酚氯仿再抽提一次，去除蛋白。个人体会，不对之处请指出。

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