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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因组DNA提取问题
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

[求助] 基因组DNA提取问题

大家好，我是做真菌研究的，在提取基因组DNA时遇到一个问题，能力有限，实在是解决不了，可是实验不能等啊，请有经验，有能力的虫友帮我解决一下，谢谢了！！
    我是用液氮研磨菌丝，氯化苄法提取的DNA，提取完之后用200 uL TE buffer溶解（完全溶解）然后用10 uLRNA酶消化过夜，结果跑电泳（见图一），然后我又用TE buffer 稀释5倍后，再跑电泳，结果（见图二），后面加大了RNA酶的量，还是同样出现这种情况，无语了，请问这是为什么？
我的问题是：DNA用TE 完全溶解后（肉眼观察是完全溶解了的）跑电泳，上面没有目的条带，下面有一团亮带，再用TE稀释5倍后，结果上面出现了很明显的目的条带，下面就基本上没有了，请问这是为什么？？

图一



图二

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-14 at 11:33 ]
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1楼 2011-12-13 10:52:30
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
怎么还是没有消息啊！！！！！！！
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2楼2011-12-13 16:20:22
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2011-12-13 19:01:04
不好意思， 我表达能力太差了！
我的问题是：DNA用TE 完全溶解后（肉眼观察是完全溶解了的）跑电泳，上面没有目的条带，下面有一团亮带，再用TE稀释5倍后，结果上面出现了很明显的目的条带，下面就基本上没有了，请问这是为什么？？
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4楼2011-12-13 17:40:44
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
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楼: Originally posted by shaoriyan at 2011-12-13 16:47:56:
看不到图片

你好，我补充了问题，图片我这是显示的，不知道为什么，请您再看一次吧，谢谢回复！
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5楼2011-12-13 17:42:19
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by gene001 at 2011-12-13 18:33:25:
第一个图RNA确实太多了，我觉得第二个图那样子你的DNA应该可以用了！！！

谢谢回复！第二张图的DNA浓度低了，做Southern不行，所以我就是想知道为什么会这样？
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8楼2011-12-13 19:59:20
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaohaiyu at 2011-12-14 09:36:45:
DNA溶解后腰放到4度至少两个小时再电泳检测吧

放4度？我都是放37度用RNA酶消化过夜，然后跑电泳的
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11楼2011-12-14 10:12:01
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by yunchemowang at 2011-12-14 10:52:50:
像上面所说得那样，第一张图下面是RNA，第二张图应该可以用。我提DNA也不用试剂盒，用CTAB法提的，如果不加RNA酶，都是会像第一张图那样下面一大坨，但是上面一般都有带，再跑跑试试，是不是点样量的问题。

谢谢!  请问你最后用多少微升的TE溶解DNA？按0.5g菌丝量来说！
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14楼2011-12-14 13:36:21
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by 航航宝贝 at 2011-12-14 10:35:20:
你好，我建议你用试剂盒提取，以备后期试验用

谢谢回复
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17楼2011-12-14 19:06:15
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by coolsc at 2011-12-14 18:42:22:
实验出现过楼主的情况，第一张图中是RNA，第二张图中虽然现DNA条带，但貌似也有微弱的RNA在下端出现。建议楼主取样再次检测，有时初提样品肉眼很难判断是否溶解完全，二次检测很有必要。经验所限，希望能有些帮助~

谢谢回复
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18楼2011-12-14 19:06:25
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by foreverjohn at 2011-12-14 18:46:33:
我提取时刚开始也出现过这样的问题，我觉得（1）尽量不要使用对数生长期的细胞，这时候RNA含量较多。（2）液氮研磨确实能很好地防止降解，个人觉得DNase比较脆弱，并且其活性需要二价阳离子，所以在提取DNA时一般 ...

谢谢回复！请问加多少RNase合适呢？
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19楼2011-12-14 19:09:14
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