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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 全血基因组的提取问题
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古韵清音

银虫 (小有名气)

[求助] 全血基因组的提取问题

我昨天用axygen的全血基因组提取试剂盒提了20多个血液样本，因为时间来不及，就分装了20ul放在4℃冰箱里今天下午来跑胶，结果虽然都在20kbp左右，但是除了个别以外，条带都很暗，很勉强看得到一点，即使看得到的也都很细稀释50倍的浓度根本测不出来。我看了我师兄的毕业论文，他也是用的axygen的试剂盒，但是他的条带都很亮，浓度有20~30ng/ul，我是第一次做这个，实验室其他人也都没有做这方面的，想请问一下问题出在哪里呢？

我用的是EDTA K2的抗凝全血，在医院4度冰箱已经放了一天了，拿回来的时候已经分层，我上下颠倒混匀后吸取的250ul的体积进行抽提。加AP2后涡旋至整管由暗红色变成棕色泥浆状，最后65℃TE加了140ul，不知道是不是有点太多了。跑胶用的0.7%，90V，45min


请大家帮忙看看问题会在哪里吧，谢谢大家！
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1楼 2011-11-12 22:23:53
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励新朋友回帖应助！谢谢！ 2011-11-14 16:26:51
古韵清音(金币+4): 谢谢，以后遇到问题希望还能向你请教 2011-11-14 16:57:34
200ul 血液（人）的DNA产量约5-10ug。人不一样产量不一样。
稀释50倍测不了那你使用原液测呗，NanoDrop可以直接使用1ul的样品测的，你看哪有使用此仪器的。你稀释50倍才测的估计是老式的紫外，使用比色杯的。
EDTA抗凝血没有问题。4度冰箱放一天不至于影响血液DNA的提取，虽然比起新鲜血液产量稍低一点点。
血液提取（你是使用硅胶柱还是异丙醇沉淀？）关键地方在消化这一步骤上。要确保充满消化，使其DNA释放出来。
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伟大航线....
2楼2011-11-13 14:31:08
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longrna

新虫 (正式写手)
确保血液充分消化是关键。另外如用硅胶柱提取，洗脱也比较关键。
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伟大航线....
3楼2011-11-13 14:32:36
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古韵清音

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-13 14:31:08:
200ul 血液（人）的DNA产量约5-10ug。人不一样产量不一样。
稀释50倍测不了那你使用原液测呗，NanoDrop可以直接使用1ul的样品测的，你看哪有使用此仪器的。你稀释50倍才测的估计是老式的紫外，使用比色杯的。
E ...

原液测，最亮的一管也只有17.5ug/ml，其余很多原液测也测不出来。我们实验室只有genequant，是老式的紫外。
axygen的试剂盒是硅胶柱离心的，第一步是500ul细胞裂解液加250ul混匀的全血，涡旋10s，第二步是蛋白沉淀液加入后涡旋10s，我也有点怀疑是没有消化好的缘故，因为A260/280的值倒是正常的，没有蛋白质污染。那我是不是应该适当加大细胞裂解液的用量呢？
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4楼2011-11-13 20:41:11
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longrna

新虫 (正式写手)
试剂盒的操作及用量最好不要随便更改。建议你联系一下axygen技术支持，有时候试剂公司的技术支持能够帮上很大的忙，毕竟他们会遇到各种各样的客户情况，说不定他之前也处理过像你遇到的这种情况。

另外想问一下，最后你用多少溶液洗脱？从这个17.5ug/ml无法推算你得到多少ug DNA.....
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伟大航线....
5楼2011-11-14 09:30:51
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古韵清音

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 古韵清音 at 2011-11-13 20:41:11:
原液测，最亮的一管也只有17.5ug/ml，其余很多原液测也测不出来。我们实验室只有genequant，是老式的紫外。
axygen的试剂盒是硅胶柱离心的，第一步是500ul细胞裂解液加250ul混匀的全血，涡旋10s，第二步是蛋白沉 ...

80ul洗脱的，TE加热到65℃。这个是最亮的一条，其他的原液测也测不出来。。。恩，我还是打电话问一下axygen的技术支持吧
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6楼2011-11-14 14:01:38
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古韵清音

银虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励及时回馈结果，有奖励！ 2011-11-14 16:28:24
引用回帖:
4楼: Originally posted by 古韵清音 at 2011-11-13 20:41:11:
原液测，最亮的一管也只有17.5ug/ml，其余很多原液测也测不出来。我们实验室只有genequant，是老式的紫外。
axygen的试剂盒是硅胶柱离心的，第一步是500ul细胞裂解液加250ul混匀的全血，涡旋10s，第二步是蛋白沉 ...

唔。。。他们说我可能是振荡不够剧烈。。。
无水乙醇我用的是分析纯的，问题应该不出在这上面
囧。。。只能再试一次了
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7楼2011-11-14 14:25:40
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