应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题
111/1返回列表
查看: 2304  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

802311820

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题

最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．        将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．        加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。
3．        加3ml STE 溶液，充分悬浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混匀后37℃温浴60 min。
4．        加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃温浴2h。
5．        加入5MNaCl（850μl），使终浓度为1M，充分混匀。
6．        加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，4℃14,000rpm，离心5min，吸上层水相于另一干净离心管中。
7．        再加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀后4℃ 6,000rpm，离心10min，吸上层水相于另一干净离心管中。
8．        加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃温浴60min。
9．        重复步骤6和步骤7，直至中间无蛋白层。
10. 加等倍体积的预冷异丙醇，用玻璃棒缠出丝状DNA。
11．用70%的乙醇进行脱盐处理后自然风干。

现提取同一属的四株菌，结果其它3株很容易就提取出来了，而且DNA量还比较大，但是有一株无论如何也不能在最后卷出DNA。

该菌培养3或4d，除蛋白时发现蛋白层很厚，培养2d的话除蛋白时蛋白层比较薄。这是什么原因？为什么这个菌这么难搞定？
同时镜检观察4d 和 2d 的菌体都没有自溶现象。


该菌为革兰氏阴性菌，换用CTAB法提取，最后仍是无法卷出DNA丝（离心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁应该没什么问题，可就是无法得到那种卷出的DNA丝。

[ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-04-13 11:30:54
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeyun0213

银虫 (小有名气)
★
802311820(金币+1):谢谢参与
我们直接买的天根提基因组DNA的试剂盒
也不贵提的出来非常好
相当初我刚去实验室就给师姐提
之前都没见过直接按试剂盒操作步骤来的提的DNA浓度纯度都非常好
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-04-13 11:45:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 11:45:28:
我们直接买的天根提基因组DNA的试剂盒
也不贵提的出来非常好
相当初我刚去实验室就给师姐提
之前都没见过直接按试剂盒操作步骤来的提的DNA浓度纯度都非常好

用试剂盒提出来的DNA量多吗，我需要量很大，要0.5mg吧，这个量能达到吗？
赞一下 回复此楼
3楼2011-04-13 11:54:34
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeyun0213

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 热心鼓励 2011-04-13 13:28:58
你可以多用几个柱子
洗脱的时候洗脱液洗完一个柱子如果DNA浓度达不到可以吸起来再洗一个柱子
一开始收集菌液也可以多离心几次收集，也可以多准备几管菌液
这个试剂盒效率还蛮高应该可以的
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-04-13 12:00:48
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
★
802311820(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 11:30:54:
最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．        将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．        加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。 ...

原因可能有2个，1个是你这个菌株是革兰氏阳性的，2可能是蛋白干扰
建议将样品反复冻溶几次或者用液氮研磨
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-04-13 12:13:54
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 12:00:48:
你可以多用几个柱子
洗脱的时候洗脱液洗完一个柱子如果DNA浓度达不到可以吸起来再洗一个柱子
一开始收集菌液也可以多离心几次收集，也可以多准备几管菌液
这个试剂盒效率还蛮高应该可以的

很久以前用过进口的试剂盒，纯度倒是不错，就是量太少了，远远不够用，后来就干脆放弃试剂盒，直接手工提取，每次提取量都很大，纯度也不错。就这样一直到现在，但没想到有的菌会有这种特殊情况，现在就想找到原因，看怎么改进能够把这株菌提出来。
谢谢您提供的资料。
赞一下 回复此楼
6楼2011-04-13 12:14:38
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:13:54:
原因可能有2个，1个是你这个菌株是革兰氏阳性的，2可能是蛋白干扰
建议将样品反复冻溶几次或者用液氮研磨

这个是革兰氏阴性的，和另外提出来的3株菌是同一菌属的。
这个蛋白干扰，是说除蛋白时连DNA也一起除去了吗？蛋白层薄厚有什么影响吗？
蛋白层厚是说明蛋白还没有降解吗？
赞一下 回复此楼
7楼2011-04-13 12:18:34
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 12:18:34:
这个是革兰氏阴性的，和另外提出来的3株菌是同一菌属的。
这个蛋白干扰，是说除蛋白时连DNA也一起除去了吗？蛋白层薄厚有什么影响吗？
蛋白层厚是说明蛋白还没有降解吗？

主要是分泌的EPS有影响
赞一下 回复此楼
8楼2011-04-13 12:29:43
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:29:43:
主要是分泌的EPS有影响

EPS是什么？
回复此楼
9楼2011-04-13 12:52:32
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
胞外聚合物
回复此楼
10楼2011-04-13 13:41:35
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
dhd99711楼
2011-04-13 13:44  
802311820(金币+1):谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 802311820 的主题更新
111/1返回列表
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 OEbVnUOu01ol 2026-08-22 5/250 2026-08-23 21:35 by 1iADQrSZC7R6
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 19:55 by lXgU0RvNTDC9
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 8/400 2026-08-23 18:58 by lXgU0RvNTDC9
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 4/200 2026-08-23 15:30 by KM5EcsNQRBPn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 5/250 2026-08-23 14:33 by KM5EcsNQRBPn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 6/300 2026-08-23 14:21 by KM5EcsNQRBPn
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭