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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题
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802311820

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题

最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．        将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．        加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。
3．        加3ml STE 溶液，充分悬浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混匀后37℃温浴60 min。
4．        加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃温浴2h。
5．        加入5MNaCl（850μl），使终浓度为1M，充分混匀。
6．        加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，4℃14,000rpm，离心5min，吸上层水相于另一干净离心管中。
7．        再加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀后4℃ 6,000rpm，离心10min，吸上层水相于另一干净离心管中。
8．        加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃温浴60min。
9．        重复步骤6和步骤7，直至中间无蛋白层。
10. 加等倍体积的预冷异丙醇，用玻璃棒缠出丝状DNA。
11．用70%的乙醇进行脱盐处理后自然风干。

现提取同一属的四株菌，结果其它3株很容易就提取出来了，而且DNA量还比较大，但是有一株无论如何也不能在最后卷出DNA。

该菌培养3或4d，除蛋白时发现蛋白层很厚，培养2d的话除蛋白时蛋白层比较薄。这是什么原因？为什么这个菌这么难搞定？
同时镜检观察4d 和 2d 的菌体都没有自溶现象。


该菌为革兰氏阴性菌，换用CTAB法提取，最后仍是无法卷出DNA丝（离心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁应该没什么问题，可就是无法得到那种卷出的DNA丝。

[ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ]
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1楼 2011-04-13 11:30:54
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yeyun0213

银虫 (小有名气)
★
802311820(金币+1):谢谢参与
我们直接买的天根提基因组DNA的试剂盒
也不贵提的出来非常好
相当初我刚去实验室就给师姐提
之前都没见过直接按试剂盒操作步骤来的提的DNA浓度纯度都非常好
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我得坚持坚持在坚持
2楼2011-04-13 11:45:28
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802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 11:45:28:
我们直接买的天根提基因组DNA的试剂盒
也不贵提的出来非常好
相当初我刚去实验室就给师姐提
之前都没见过直接按试剂盒操作步骤来的提的DNA浓度纯度都非常好

用试剂盒提出来的DNA量多吗，我需要量很大，要0.5mg吧，这个量能达到吗？
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3楼2011-04-13 11:54:34
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yeyun0213

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 热心鼓励 2011-04-13 13:28:58
你可以多用几个柱子
洗脱的时候洗脱液洗完一个柱子如果DNA浓度达不到可以吸起来再洗一个柱子
一开始收集菌液也可以多离心几次收集，也可以多准备几管菌液
这个试剂盒效率还蛮高应该可以的
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我得坚持坚持在坚持
4楼2011-04-13 12:00:48
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
★
802311820(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 11:30:54:
最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．        将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．        加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。 ...

原因可能有2个，1个是你这个菌株是革兰氏阳性的，2可能是蛋白干扰
建议将样品反复冻溶几次或者用液氮研磨
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5楼2011-04-13 12:13:54
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802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 12:00:48:
你可以多用几个柱子
洗脱的时候洗脱液洗完一个柱子如果DNA浓度达不到可以吸起来再洗一个柱子
一开始收集菌液也可以多离心几次收集，也可以多准备几管菌液
这个试剂盒效率还蛮高应该可以的

很久以前用过进口的试剂盒，纯度倒是不错，就是量太少了，远远不够用，后来就干脆放弃试剂盒，直接手工提取，每次提取量都很大，纯度也不错。就这样一直到现在，但没想到有的菌会有这种特殊情况，现在就想找到原因，看怎么改进能够把这株菌提出来。
谢谢您提供的资料。
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6楼2011-04-13 12:14:38
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802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:13:54:
原因可能有2个，1个是你这个菌株是革兰氏阳性的，2可能是蛋白干扰
建议将样品反复冻溶几次或者用液氮研磨

这个是革兰氏阴性的，和另外提出来的3株菌是同一菌属的。
这个蛋白干扰，是说除蛋白时连DNA也一起除去了吗？蛋白层薄厚有什么影响吗？
蛋白层厚是说明蛋白还没有降解吗？
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7楼2011-04-13 12:18:34
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 12:18:34:
这个是革兰氏阴性的，和另外提出来的3株菌是同一菌属的。
这个蛋白干扰，是说除蛋白时连DNA也一起除去了吗？蛋白层薄厚有什么影响吗？
蛋白层厚是说明蛋白还没有降解吗？

主要是分泌的EPS有影响
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8楼2011-04-13 12:29:43
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802311820

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:29:43:
主要是分泌的EPS有影响

EPS是什么？
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9楼2011-04-13 12:52:32
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
胞外聚合物
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10楼2011-04-13 13:41:35
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dhd99711楼
2011-04-13 13:44  
802311820(金币+1):谢谢参与
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