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【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题
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最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。 方法如下： 1． 将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。 2． 加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。 3． 加3ml STE 溶液，充分悬浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混匀后37℃温浴60 min。 4． 加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃温浴2h。 5． 加入5MNaCl（850μl），使终浓度为1M，充分混匀。 6． 加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，4℃14,000rpm，离心5min，吸上层水相于另一干净离心管中。 7． 再加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀后4℃ 6,000rpm，离心10min，吸上层水相于另一干净离心管中。 8． 加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃温浴60min。 9． 重复步骤6和步骤7，直至中间无蛋白层。 10. 加等倍体积的预冷异丙醇，用玻璃棒缠出丝状DNA。 11．用70%的乙醇进行脱盐处理后自然风干。 现提取同一属的四株菌，结果其它3株很容易就提取出来了，而且DNA量还比较大，但是有一株无论如何也不能在最后卷出DNA。 该菌培养3或4d，除蛋白时发现蛋白层很厚，培养2d的话除蛋白时蛋白层比较薄。这是什么原因？为什么这个菌这么难搞定？ 同时镜检观察4d 和 2d 的菌体都没有自溶现象。 该菌为革兰氏阴性菌，换用CTAB法提取，最后仍是无法卷出DNA丝（离心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁应该没什么问题，可就是无法得到那种卷出的DNA丝。 [ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ] |
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