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802311820

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】关于提取基因组DNA过程中遇到的难题

最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。
3．加3ml STE 溶液，充分悬浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混匀后37℃温浴60 min。
4．加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃温浴2h。
5．加入5MNaCl（850μl），使终浓度为1M，充分混匀。
6．加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，4℃14,000rpm，离心5min，吸上层水相于另一干净离心管中。
7．再加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀后4℃ 6,000rpm，离心10min，吸上层水相于另一干净离心管中。
8．加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃温浴60min。
9．重复步骤6和步骤7，直至中间无蛋白层。
10. 加等倍体积的预冷异丙醇，用玻璃棒缠出丝状DNA。
11．用70%的乙醇进行脱盐处理后自然风干。

现提取同一属的四株菌，结果其它3株很容易就提取出来了，而且DNA量还比较大，但是有一株无论如何也不能在最后卷出DNA。

该菌培养3或4d，除蛋白时发现蛋白层很厚，培养2d的话除蛋白时蛋白层比较薄。这是什么原因？为什么这个菌这么难搞定？
同时镜检观察4d 和 2d 的菌体都没有自溶现象。

该菌为革兰氏阴性菌，换用CTAB法提取，最后仍是无法卷出DNA丝（离心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁应该没什么问题，可就是无法得到那种卷出的DNA丝。

[ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ]

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1楼 2011-04-13 11:30:54

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wolfebst

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★
802311820(金币+1):谢谢参与

引用回帖:

Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 11:30:54:
最近在提取基因组DNA，遇到一个难题。
方法如下：
1．将待测菌体和模式菌株培养至对数生长期，取50ml培养液，4℃ 14,000rpm离心5min。
2．加5ml 0.85% NaCl溶液，充分悬浮后4℃ 14,000rpm离心5min，弃上清。 ...

原因可能有2个，1个是你这个菌株是革兰氏阳性的，2可能是蛋白干扰
建议将样品反复冻溶几次或者用液氮研磨