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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by xiaohaiyu at 2011-12-14 09:36:45:
DNA溶解后腰放到4度至少两个小时再电泳检测吧

放4度?我都是放37度用RNA酶消化过夜,然后跑电泳的
11楼2011-12-14 10:12:01
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航航宝贝

银虫 (正式写手)

你好,我建议你用试剂盒提取,以备后期试验用

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加油,博友们
12楼2011-12-14 10:35:20
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yunchemowang

铁虫 (初入文坛)

像上面所说得那样,第一张图下面是RNA,第二张图应该可以用。我提DNA也不用试剂盒,用CTAB法提的,如果不加RNA酶,都是会像第一张图那样下面一大坨,但是上面一般都有带,再跑跑试试,是不是点样量的问题。

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13楼2011-12-14 10:52:50
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by yunchemowang at 2011-12-14 10:52:50:
像上面所说得那样,第一张图下面是RNA,第二张图应该可以用。我提DNA也不用试剂盒,用CTAB法提的,如果不加RNA酶,都是会像第一张图那样下面一大坨,但是上面一般都有带,再跑跑试试,是不是点样量的问题。

谢谢!  请问你最后用多少微升的TE溶解DNA?按0.5g菌丝量来说!
14楼2011-12-14 13:36:21
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coolsc

金虫 (小有名气)

实验出现过楼主的情况,第一张图中是RNA,第二张图中虽然现DNA条带,但貌似也有微弱的RNA在下端出现。建议楼主取样再次检测,有时初提样品肉眼很难判断是否溶解完全,二次检测很有必要。经验所限,希望能有些帮助~

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15楼2011-12-14 18:42:22
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foreverjohn

金虫 (小有名气)

我提取时刚开始也出现过这样的问题,我觉得(1)尽量不要使用对数生长期的细胞,这时候RNA含量较多。(2)液氮研磨确实能很好地防止降解,个人觉得DNase比较脆弱,并且其活性需要二价阳离子,所以在提取DNA时一般要加入EDTA,因此在加入足量的EDTA(10-50mM)条件下,DNA一般不会降解(个人体会),所以提取过程其实没必要保持很低温度,相反较高的温度可以降解掉RNA,对你的提取有利,但是尽量减少剪切,振荡温和点,枪头剪掉前面部分等。(3)RNase可以在研磨时就加进去,增加消化的时间,沉淀溶解时,不要太浓,体系可以大一点,加入RNase酶消化,效果比较好,消化时可以使用50度,一般半小时以内就可以消化殆尽,这时可以再用酚氯仿再抽提一次,去除蛋白。个人体会,不对之处请指出。

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16楼2011-12-14 18:46:33
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by 航航宝贝 at 2011-12-14 10:35:20:
你好,我建议你用试剂盒提取,以备后期试验用

谢谢回复
17楼2011-12-14 19:06:15
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by coolsc at 2011-12-14 18:42:22:
实验出现过楼主的情况,第一张图中是RNA,第二张图中虽然现DNA条带,但貌似也有微弱的RNA在下端出现。建议楼主取样再次检测,有时初提样品肉眼很难判断是否溶解完全,二次检测很有必要。经验所限,希望能有些帮助~

谢谢回复
18楼2011-12-14 19:06:25
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by foreverjohn at 2011-12-14 18:46:33:
我提取时刚开始也出现过这样的问题,我觉得(1)尽量不要使用对数生长期的细胞,这时候RNA含量较多。(2)液氮研磨确实能很好地防止降解,个人觉得DNase比较脆弱,并且其活性需要二价阳离子,所以在提取DNA时一般 ...

谢谢回复!请问加多少RNase合适呢?
19楼2011-12-14 19:09:14
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师

引用回帖:
8楼: Originally posted by 棒哈哈 at 2011-12-13 19:59:20:
谢谢回复!第二张图的DNA浓度低了,做Southern不行,所以我就是想知道为什么会这样?

RNA酶使用前最好开水煮一下,尤其是过夜消化用的RNA酶,因为RNA酶里一般会污染有DNA酶!

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大家共同交流、共同提高!!!
20楼2011-12-14 19:35:11
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