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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因组DNA提取问题
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaohaiyu at 2011-12-14 09:36:45:
DNA溶解后腰放到4度至少两个小时再电泳检测吧

放4度？我都是放37度用RNA酶消化过夜，然后跑电泳的
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11楼2011-12-14 10:12:01
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航航宝贝

银虫 (正式写手)
你好，我建议你用试剂盒提取，以备后期试验用
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棒哈哈
加油，博友们
12楼2011-12-14 10:35:20
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yunchemowang

铁虫 (初入文坛)
像上面所说得那样，第一张图下面是RNA，第二张图应该可以用。我提DNA也不用试剂盒，用CTAB法提的，如果不加RNA酶，都是会像第一张图那样下面一大坨，但是上面一般都有带，再跑跑试试，是不是点样量的问题。
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棒哈哈
13楼2011-12-14 10:52:50
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by yunchemowang at 2011-12-14 10:52:50:
像上面所说得那样，第一张图下面是RNA，第二张图应该可以用。我提DNA也不用试剂盒，用CTAB法提的，如果不加RNA酶，都是会像第一张图那样下面一大坨，但是上面一般都有带，再跑跑试试，是不是点样量的问题。

谢谢!  请问你最后用多少微升的TE溶解DNA？按0.5g菌丝量来说！
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14楼2011-12-14 13:36:21
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coolsc

金虫 (小有名气)
实验出现过楼主的情况，第一张图中是RNA，第二张图中虽然现DNA条带，但貌似也有微弱的RNA在下端出现。建议楼主取样再次检测，有时初提样品肉眼很难判断是否溶解完全，二次检测很有必要。经验所限，希望能有些帮助~
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棒哈哈
15楼2011-12-14 18:42:22
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
我提取时刚开始也出现过这样的问题，我觉得（1）尽量不要使用对数生长期的细胞，这时候RNA含量较多。（2）液氮研磨确实能很好地防止降解，个人觉得DNase比较脆弱，并且其活性需要二价阳离子，所以在提取DNA时一般要加入EDTA，因此在加入足量的EDTA（10-50mM）条件下，DNA一般不会降解（个人体会），所以提取过程其实没必要保持很低温度，相反较高的温度可以降解掉RNA，对你的提取有利，但是尽量减少剪切，振荡温和点，枪头剪掉前面部分等。（3）RNase可以在研磨时就加进去，增加消化的时间，沉淀溶解时，不要太浓，体系可以大一点，加入RNase酶消化，效果比较好，消化时可以使用50度，一般半小时以内就可以消化殆尽，这时可以再用酚氯仿再抽提一次，去除蛋白。个人体会，不对之处请指出。
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棒哈哈
16楼2011-12-14 18:46:33
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by 航航宝贝 at 2011-12-14 10:35:20:
你好，我建议你用试剂盒提取，以备后期试验用

谢谢回复
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17楼2011-12-14 19:06:15
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by coolsc at 2011-12-14 18:42:22:
实验出现过楼主的情况，第一张图中是RNA，第二张图中虽然现DNA条带，但貌似也有微弱的RNA在下端出现。建议楼主取样再次检测，有时初提样品肉眼很难判断是否溶解完全，二次检测很有必要。经验所限，希望能有些帮助~

谢谢回复
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18楼2011-12-14 19:06:25
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by foreverjohn at 2011-12-14 18:46:33:
我提取时刚开始也出现过这样的问题，我觉得（1）尽量不要使用对数生长期的细胞，这时候RNA含量较多。（2）液氮研磨确实能很好地防止降解，个人觉得DNase比较脆弱，并且其活性需要二价阳离子，所以在提取DNA时一般 ...

谢谢回复！请问加多少RNase合适呢？
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19楼2011-12-14 19:09:14
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
引用回帖:
8楼: Originally posted by 棒哈哈 at 2011-12-13 19:59:20:
谢谢回复！第二张图的DNA浓度低了，做Southern不行，所以我就是想知道为什么会这样？

RNA酶使用前最好开水煮一下，尤其是过夜消化用的RNA酶，因为RNA酶里一般会污染有DNA酶！
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棒哈哈
大家共同交流、共同提高！！！
20楼2011-12-14 19:35:11
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