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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？
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一度冰火

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？

本人做目的基因和PMD18-T连接，挑菌、摇菌后，对目的基因做菌液PCR筛选阳性菌株时没条带，但是我对摇出来的菌液提取质粒，然后对质粒进行目的基因PCR时跑出目的条带了，奇怪了，我前面有一次对菌液进行PCR时能跑出来，菌液PCR感觉时灵时不灵，我的PCR体系：ddH2O:14.25,BUFFER:2.5,DNTP:1,引物1:1，引物2:1，菌液：5，Taq:0.25,总共是25微升体系，哪位大侠指点下小弟呢。
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1楼2012-05-18 18:38:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
看来我们的克隆不同 我一般做2kb以上的 所以都不会有假阳性 只能说有假阴性存在 如果你是很短片段的话 假阳性确实头疼（TA克隆比较常见 最好预处理下你的PCR产物--加A-tail前最好乙醇沉淀法做一下）当然.......我懒的做，靠检验数量取胜 或者用MultiplexPCR (最近我在尝试这种菌液检验方式）就用通用引物和你特异引物统统扔到体系里 PCR出来两条带就能证明你的菌液正确
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Let God do with it as He wills
6楼2012-05-18 23:34:07
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一度冰火 at 2012-05-18 22:28:42:
额，菌液PCR前要做菌液PCR吗，我做菌液PCR时直接吸取了5微升的菌液，不知道怎么处理菌液破壁呢，如果不采取破壁处理直接吸取摇好的菌液可以吗？

我做菌液PCR前都要经过破菌处理，方法如下：取50微菌液，离心去上清，用20ul灭菌水重悬菌体，沸水煮10分钟，使菌体充分裂解。此取2ul即为PCR模板.
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9楼2012-05-21 15:06:23
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普通回帖

动力泉

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
觉得应该是菌液破壁处理时没做好，建议做菌液PCR前看看有质粒没
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好好学习
2楼2012-05-18 18:59:58
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一度冰火

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 动力泉 at 2012-05-18 18:59:58:
觉得应该是菌液破壁处理时没做好，建议做菌液PCR前看看有质粒没

额，菌液PCR前要做菌液PCR吗，我做菌液PCR时直接吸取了5微升的菌液，不知道怎么处理菌液破壁呢，如果不采取破壁处理直接吸取摇好的菌液可以吗？
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3楼2012-05-18 22:28:42
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
一度冰火: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-18 23:26:13
嗯.............
       为什么要纠结在菌液PCR的成功率上呢 质粒PCR成功就已经是可以证明插入正确的了 个人觉得菌液PCR只是鉴定步骤 还要溶壁酶来处理后才做PCR是不是有些小题大做了呢？
       个人做法流程 一边保菌一边鉴定 像这种TA Clone 做10~20个鉴定/plate 试片段大小再调整鉴定数量 若没有阳性 再次做挑菌鉴定 还是一边保菌一边鉴定 直到把菌挑完60%左右 若你还没有阳性 就挑前边保菌摇大后提10个左右质粒 再PCR 若还没有 那就重新亚克隆吧..................
       说实话 从来没有考虑过因为菌的原因扩不出来 大肠和农杆的我都木有碰到这种情况
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Let God do with it as He wills
4楼2012-05-18 22:41:52
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一度冰火

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-18 22:41:52:
嗯.............
       为什么要纠结在菌液PCR的成功率上呢 质粒PCR成功就已经是可以证明插入正确的了 个人觉得菌液PCR只是鉴定步骤 还要溶壁酶来处理后才做PCR是不是有些小题大做了呢？
       个人做法流程  ...

嗯，其实我在意识到能通过菌液PCR前也是你这样做的，但是考虑到会把假阳性菌株当成目的质粒进行摇菌和双酶切，如果真的遇到假阳性的话会浪费很多时间，不过话说我感觉菌液PCR也未必可信，摇菌后提出质粒能跑出目的基因就够了，呵呵，受教了！
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5楼2012-05-18 23:24:46
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fly12365

铜虫 (初入文坛)
用菌落直接点样，有可能菌液浓度大了，或者提质粒酶切
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7楼2012-05-20 22:15:49
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小山店

新虫 (初入文坛)
我上次也是，开始一直相信菌液PCR，一直以为没有，纠结了一个月，后来提质粒，做PCR，有了。
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8楼2012-05-20 22:55:04
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懿飞

新虫 (初入文坛)
实验过程中遇到相同的问题，看了大家的帖子，受益了
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10楼2012-05-21 16:39:28
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