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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Xhol 酶切不能切开
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lovelyzxj

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】Xhol 酶切不能切开 已有8人参与

在上游引物中引入EcoR1酶切位点，在下游引物中引入Xho1酶切位点。pcr产物连接在PMD19-T simple vector上后，提取质粒做酶切后，EcoR1可以切开，Xho1不能切开。用同样的酶切体系切另外的质粒，可以切开，而且测序后酶切位点没有出现问题，现在正在找原因，求助。
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1楼 2010-05-17 14:29:47
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jasco

木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-17 17:06:46
甲基化影响，转化不含甲基化酶的菌株
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2楼2010-05-17 17:05:23
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ottolzm

木虫 (正式写手)
★
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呃  我马上要做基因工程菌了 我选的pET20b 酶切位点也是上游引物中加入EcoR1酶切位点，下游引物中引入Xho1酶切位点，你这结果犹如当头棒呀 呵呵 赶紧顶起来 同样求解  求助求助
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3楼2010-05-17 20:45:32
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lovelyzxj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ottolzm at 2010-05-17 20:45:32:
呃  我马上要做基因工程菌了 我选的pET20b 酶切位点也是上游引物中加入EcoR1酶切位点，下游引物中引入Xho1酶切位点，你这结果犹如当头棒呀 呵呵 赶紧顶起来 同样求解  求助求助 :sw ...

我有另外的片段连的也是另外的T载体，选择的是同样的酶切位点，切开是没有问题的，不知道到这里就卡了是为什么。
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4楼2010-05-17 21:34:26
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lovelyzxj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-05-17 17:05:23:
甲基化影响，转化不含甲基化酶的菌株

谢了，准备试试
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5楼2010-05-17 21:35:56
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★
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我也出现过同样的问题，我后来就不连T载体了，直接连接到最终载体，就切开了
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6楼2010-05-17 23:24:45
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小白兄

金虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~~ 2010-05-18 13:33:40
一种是因为酶切位点甲基化了。还有就是你是单切还是双切？双切的话两个酶切位点靠的太近也会导致一个酶切不开的。
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时光如流水，匆匆而过。
7楼2010-05-17 23:28:08
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ottolzm

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ottolzm at 2010-05-17 20:45:32:
呃  我马上要做基因工程菌了 我选的pET20b 酶切位点也是上游引物中加入EcoR1酶切位点，下游引物中引入Xho1酶切位点，你这结果犹如当头棒呀 呵呵 赶紧顶起来 同样求解  求助求助 :sw ...

哦 这样呀 看来还是和质粒有关的 赶紧做实验 看看结果 多多交流 多多交流
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8楼2010-05-18 08:31:11
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
甲基化不太可能，这个位点一般不受影响的～，倒是有可能质粒本身有问题～
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9楼2010-05-18 13:14:17
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lovelyzxj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-17 23:24:45:
我也出现过同样的问题，我后来就不连T载体了，直接连接到最终载体，就切开了

嗯，考虑到Xho1酶切位点的保护碱基随便加了两个碱基，而且胶回收后片段损失较多，还没尝试。
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10楼2010-05-18 15:09:36
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