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w26150665w铜虫 (正式写手)
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EcoRI 酶切细菌基因组切不开
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为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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w26150665w
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10楼2012-03-23 14:32:09
【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 分析有理，且证据充分^_^ 2012-03-25 14:26:05
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我没切过大基因组，但就我切大质粒（45kb左右）时发现很明显切出来小的片断很暗，不仔细看基本看不出，条带的亮度随片断大小的增大而增大，最小的300bp与最大的27kb的亮度相差相当大（见附图，共6条，右边是marker，最小的marker500bp，仔细看，在模糊的RNA带和500bp marker间还是可以看到最小条带的）。其实也显而易见，切的所有片断摩尔量都一样，自然片断越大越亮。有的时候质粒提的浓度不够，酶切只看到大条带。所以我觉得可能你的有切出片断来，但照你切着基因组的亮度来看，跑胶是看不到的切出的小条带的，我质粒提的都还比你的亮呢，小条带不还少得几乎看不见，你基因组肯定大于45kb吧，那情况就更严重了说不定。 当然，这只是我个人看法。  |
12楼2012-03-23 21:27:40
w26150665w
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17楼2012-03-24 15:42:01
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【答案】应助回帖
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w26150665w: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-23 22:17:45
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有两个问题： 你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？ 你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 如果上述两个问题，你都清楚了，我建议你用Double digestion designer设计你的酶切反应体系。 http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php，可以申请免费使用。 我前不久，刚利用此系统成功设计了一个很困难的部分酶切，还不错，你可以试一试，希望对你有帮助。 |
2楼2012-03-22 20:34:09
3楼2012-03-22 21:38:58
w26150665w
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4楼2012-03-23 09:48:57
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8楼2012-03-23 14:17:01
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9楼2012-03-23 14:22:18
