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w26150665w

铜虫 (正式写手)

[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！
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1楼2012-03-22 18:26:02
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回帖置顶 ( 共有3个 )

w26150665w

铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:24:53
这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。

这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。
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10楼2012-03-23 14:32:09
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 分析有理，且证据充分^_^ 2012-03-25 14:26:05
我没切过大基因组，但就我切大质粒（45kb左右）时发现很明显切出来小的片断很暗，不仔细看基本看不出，条带的亮度随片断大小的增大而增大，最小的300bp与最大的27kb的亮度相差相当大（见附图，共6条，右边是marker，最小的marker500bp，仔细看，在模糊的RNA带和500bp marker间还是可以看到最小条带的）。其实也显而易见，切的所有片断摩尔量都一样，自然片断越大越亮。有的时候质粒提的浓度不够，酶切只看到大条带。所以我觉得可能你的有切出片断来，但照你切着基因组的亮度来看，跑胶是看不到的切出的小条带的，我质粒提的都还比你的亮呢，小条带不还少得几乎看不见，你基因组肯定大于45kb吧，那情况就更严重了说不定。
当然，这只是我个人看法。
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
12楼2012-03-23 21:27:40
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:26:26
昨天的电泳跑出了类似“拖尾”的条带，是不是说明我切开了啊，各位？

左到右：切前，切3、4h后
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17楼2012-03-24 15:42:01
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-03-25 14:25:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by w26150665w at 2012-03-23 09:50:37:
NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。

我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合的蛋白可能会抑制酶切，估计要再抽提一下，或者残留有乙醇之类。
其它的我也想不到什么原因了，等高手咯

方便的话，上个图让大家looklook吧
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6楼2012-03-23 10:27:18
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普通回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 好吧，我记得你，你还在推荐你的软件呢 2012-03-23 14:41:52
w26150665w: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-23 22:17:45
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。
如果上述两个问题，你都清楚了，我建议你用Double digestion designer设计你的酶切反应体系。
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php，可以申请免费使用。
我前不久，刚利用此系统成功设计了一个很困难的部分酶切，还不错，你可以试一试，希望对你有帮助。
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2楼2012-03-22 20:34:09
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？
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3楼2012-03-22 21:38:58
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-22 20:34:09:
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 ...

谢谢，我的DNA纯度在抽提后测了吸光值的，就是1.05ug/ul，我在酶切反应中加了4ul、2ul、1.5ul都切不开的，每次反应的时间呈梯度6-10小时。今天做1ul的。因为师兄用过酶，EcoRI 说是没问题，我用NdeI 切过10小时，也是没切开。
试验进度卡住了。。。很急。。。
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多多交流学习
4楼2012-03-23 09:48:57
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-22 21:38:58:
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？

NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。
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5楼2012-03-23 09:50:37
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Im_suvii

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-03-25 14:24:50
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？
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小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
7楼2012-03-23 11:32:20
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Im_suvii at 2012-03-23 11:32:20:
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？

谢谢，没测过序，但是16S鉴定过菌属。如果是基因内部的问题，那我就只能重抽了。
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8楼2012-03-23 14:17:01
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-23 10:27:18:
我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合 ...

嗯，谢谢。因为 我的质粒用EcoRI 是可以切开的 说明酶没有问题，我也用ndeI 切了，也是没切开。基因组OD260/od280=1.85，纯了吧，残留乙醇。。。有可能。。。我快投降了。。。
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9楼2012-03-23 14:22:18
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