应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » EcoRI 酶切细菌基因组切不开
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
201/2返回列表12下一页
查看: 3759  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

w26150665w

铜虫 (正式写手)

[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
多多交流学习
1楼 2012-03-22 18:26:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有3个 )

w26150665w

铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:24:53
这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。

这是酶切图，左到右为Marker，酶切前，6，7，8，9，10小时酶切结果。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
10楼2012-03-23 14:32:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 分析有理，且证据充分^_^ 2012-03-25 14:26:05
我没切过大基因组，但就我切大质粒（45kb左右）时发现很明显切出来小的片断很暗，不仔细看基本看不出，条带的亮度随片断大小的增大而增大，最小的300bp与最大的27kb的亮度相差相当大（见附图，共6条，右边是marker，最小的marker500bp，仔细看，在模糊的RNA带和500bp marker间还是可以看到最小条带的）。其实也显而易见，切的所有片断摩尔量都一样，自然片断越大越亮。有的时候质粒提的浓度不够，酶切只看到大条带。所以我觉得可能你的有切出片断来，但照你切着基因组的亮度来看，跑胶是看不到的切出的小条带的，我质粒提的都还比你的亮呢，小条带不还少得几乎看不见，你基因组肯定大于45kb吧，那情况就更严重了说不定。
当然，这只是我个人看法。
赞一下 回复此楼
耐得住寂寞，方能遇见繁华
12楼2012-03-23 21:27:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-03-25 14:26:26
昨天的电泳跑出了类似“拖尾”的条带，是不是说明我切开了啊，各位？

左到右：切前，切3、4h后
赞一下 回复此楼
多多交流学习
17楼2012-03-24 15:42:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-03-25 14:25:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by w26150665w at 2012-03-23 09:50:37:
NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。

我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合的蛋白可能会抑制酶切，估计要再抽提一下，或者残留有乙醇之类。
其它的我也想不到什么原因了，等高手咯

方便的话，上个图让大家looklook吧
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-03-23 10:27:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 好吧，我记得你，你还在推荐你的软件呢 2012-03-23 14:41:52
w26150665w: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-23 22:17:45
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。
如果上述两个问题，你都清楚了，我建议你用Double digestion designer设计你的酶切反应体系。
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php，可以申请免费使用。
我前不久，刚利用此系统成功设计了一个很困难的部分酶切，还不错，你可以试一试，希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-22 20:34:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-22 21:38:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-22 20:34:09:
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 ...

谢谢，我的DNA纯度在抽提后测了吸光值的，就是1.05ug/ul，我在酶切反应中加了4ul、2ul、1.5ul都切不开的，每次反应的时间呈梯度6-10小时。今天做1ul的。因为师兄用过酶，EcoRI 说是没问题，我用NdeI 切过10小时，也是没切开。
试验进度卡住了。。。很急。。。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
4楼2012-03-23 09:48:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-22 21:38:58:
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？

NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
5楼2012-03-23 09:50:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-03-25 14:24:50
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
7楼2012-03-23 11:32:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Im_suvii at 2012-03-23 11:32:20:
基因测序过么?会不会酶切位点发生了突变？如果序列正确，是不是被甲基化了或者酶有问题？

谢谢，没测过序，但是16S鉴定过菌属。如果是基因内部的问题，那我就只能重抽了。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
8楼2012-03-23 14:17:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-23 10:27:18:
我的意思是基因组的ecorI位点被保护起来 了，譬如说甲基化什么的。

如果你确保酶没问题，那么换别的酶试试譬如说hindiii，sau3ai
如果都切不开，该考虑你提到基因组是否有问题。譬如说有蛋白残留，与dna结合 ...

嗯，谢谢。因为 我的质粒用EcoRI 是可以切开的 说明酶没有问题，我也用ndeI 切了，也是没切开。基因组OD260/od280=1.85，纯了吧，残留乙醇。。。有可能。。。我快投降了。。。
赞一下 回复此楼
多多交流学习
9楼2012-03-23 14:22:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 w26150665w 的主题更新
201/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕322 +7 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-05 7/350 2026-04-06 00:50 by fmesaito
[考研] 329求调剂 +17 miaodesi 2026-04-02 20/1000 2026-04-05 18:33 by 蓝云思雨
[考研] 288求调剂 +7 没有答案_ 2026-04-05 7/350 2026-04-05 17:01 by yulian1987
[考研] 材料与化工363求推荐 +7 zh096 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:11 by 陌秋26
[考研] 0835学硕299求调剂 08大类可接受 +5 useryy 2026-04-03 5/250 2026-04-04 20:07 by 蓝云思雨
[考研] 材料383求调剂 +5 郭阳阳阳成 2026-04-04 5/250 2026-04-04 19:06 by dongzh2009
[考研] 280求调剂 +21 咕噜晓晓 2026-04-02 22/1100 2026-04-04 11:12 by 猪会飞
[考研] 268求调剂 +8 你好tg 2026-04-03 9/450 2026-04-04 05:08 by gswylq
[考研] 求材料调剂，一志愿郑州大学289分 +15 硕星赴 2026-04-03 15/750 2026-04-04 01:01 by userper
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +5 崔wj 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:06 by arrow8852
[考研] 英一数一408，总分284，二战真诚求调剂 +13 12.27 2026-03-30 15/750 2026-04-03 14:41 by 氮气气气
[硕博家园] 求老师收留 +9 lllq123 2026-04-03 9/450 2026-04-03 13:48 by 呼吸都是减肥
[考研] 321求调剂 +17 y-yh 2026-04-01 20/1000 2026-04-03 12:57 by y-yh
[考研] 315分 085602 求调剂 +15 26考研上岸版26 2026-04-02 15/750 2026-04-03 12:45 by xingguangj
[考研] 材料调剂 +4 一样YWY 2026-04-03 4/200 2026-04-03 09:48 by 蓝云思雨
[考研] 348求调剂 +11 zzzzyk123 2026-04-01 11/550 2026-04-02 16:52 by Wang200018
[考研] 275学硕081000服从调剂到其他专业，保不住本专业了 +7 一只小小水牛 2026-04-02 8/400 2026-04-02 14:23 by alice-2022
[考研] 08工科275求调剂，可跨考。 +5 AaAa7420 2026-03-31 5/250 2026-04-01 15:21 by 159357hjz
[考研] 求调剂：一志愿：南京大学 专业：0705 总分320 ，本科985，四六级已过 +3 lfy760306 2026-03-31 3/150 2026-04-01 01:57 by Creta
[考研] 080500-315分复试调剂 +9 上岸3821 2026-03-31 9/450 2026-03-31 17:29 by 唐沐儿
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭