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铜虫 (正式写手)

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[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！

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多多交流学习

1楼2012-03-22 18:26:02

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lincy2010

银虫 (小有名气)

MolEPI: 3
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专业: 微生物药物

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 分析有理，且证据充分^_^ 2012-03-25 14:26:05

我没切过大基因组，但就我切大质粒（45kb左右）时发现很明显切出来小的片断很暗，不仔细看基本看不出，条带的亮度随片断大小的增大而增大，最小的300bp与最大的27kb的亮度相差相当大（见附图，共6条，右边是marker，最小的marker500bp，仔细看，在模糊的RNA带和500bp marker间还是可以看到最小条带的）。其实也显而易见，切的所有片断摩尔量都一样，自然片断越大越亮。有的时候质粒提的浓度不够，酶切只看到大条带。所以我觉得可能你的有切出片断来，但照你切着基因组的亮度来看，跑胶是看不到的切出的小条带的，我质粒提的都还比你的亮呢，小条带不还少得几乎看不见，你基因组肯定大于45kb吧，那情况就更严重了说不定。
当然，这只是我个人看法。