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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » EcoRI 酶切细菌基因组切不开
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w26150665w

铜虫 (正式写手)

[求助] EcoRI 酶切细菌基因组切不开

为什么我用20ul体系酶切基因组切不开，酶切体系：ddH2O ；基因组1.5-2ul（OD比为1.85，纯度应该没问题）；10*H缓冲液 2ul；酶 0.4ul。酶切时间梯度6、7、8、9、10小时，结果仍然切不开基因组，请高手帮帮忙，不胜感激！
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1楼 2012-03-22 18:26:02
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-22 20:34:09:
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。 ...

谢谢，我的DNA纯度在抽提后测了吸光值的，就是1.05ug/ul，我在酶切反应中加了4ul、2ul、1.5ul都切不开的，每次反应的时间呈梯度6-10小时。今天做1ul的。因为师兄用过酶，EcoRI 说是没问题，我用NdeI 切过10小时，也是没切开。
试验进度卡住了。。。很急。。。
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多多交流学习
4楼2012-03-23 09:48:57
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 好吧，我记得你，你还在推荐你的软件呢 2012-03-23 14:41:52
w26150665w: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-23 22:17:45
有两个问题：
你的基因组DNA定量时，浓度时多少？也就是你酶切时的DNA总量是多少？
你的buffer是H,应该用的是Takara的酶吧，你用其他有EcoRI位点的质粒测试过你的酶吗？没准，你的酶因为存储不当，已经失活了。
如果上述两个问题，你都清楚了，我建议你用Double digestion designer设计你的酶切反应体系。
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php，可以申请免费使用。
我前不久，刚利用此系统成功设计了一个很困难的部分酶切，还不错，你可以试一试，希望对你有帮助。
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2楼2012-03-22 20:34:09
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？
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3楼2012-03-22 21:38:58
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w26150665w

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-03-22 21:38:58:
什么细菌呢？是不定你的菌株对EcoRI酶切位点进行修饰了。譬如说生产EcoRI酶的工程菌的基因组就不能被该酶切开吧？

NCBI可以搜索到该细菌属中已被测序的，全基因组序列上有改酶切位点的，900多个啊。但是我疯狂地切，还是切不动，DNA纯度应该是没问题的。
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5楼2012-03-23 09:50:37
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