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沐风望野

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么酶切总是切不开? 已有11人参与

我通过同源重组得到一个大约为27Kb的质粒,已经通过其他六种酶酶切验证过其正确性了,但是接下来用MunI和XbaI双酶切质粒时根本切不开,换用这两种酶分别单酶切也切不动质粒,请问可能是什么问题呢?
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:28
楼主的质粒好大啊~
可以试试加大酶量,要不可以在网上查查相关的大片段质粒如何有效酶切的?
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-05-27 14:09:50
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catherine_

木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:39
我k...
你用这么大的质粒有啥用啊!!!
xbaI 单酶都切不动。。。你确信这个质粒的序列没问题?
3楼2010-05-27 14:16:56
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:48
很明显,质粒序列突变了,或者甲基化了。,我经常遇见,正好是要用的酶切位点有变化,唉~
4楼2010-05-27 14:35:32
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jingcp200320

银虫 (小有名气)

可以测序 看看你这两个酶切位点附近是否发生了碱基突变!
5楼2010-05-27 16:09:50
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)

我用这么大的质粒是为了做异源表达用的,之前曾经酶切正确过,难道保藏的菌种之后质粒的碱基序列也会发生突变吗?
6楼2010-07-22 11:14:31
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢交流,欢迎常来~~ 2010-07-23 11:23:57
用Xba1时一定要注意甲基化的问题,一些大肠的Dam甲基化酶可以识别GATC序列中的腺嘌呤,N6,并使其甲基化。这样一些限制酶,如Bcl1,Xba1等就切不开了。
我以前遇到过这样问题,费了大力气都切不开。
7楼2010-07-22 11:23:49
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bigbangrex

铁杆木虫 (小有名气)


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很可能是甲基化造成的,我听说有人把整个质粒都P出来再用一个酶把甲基化质粒切碎后再酶切就切得动了。可是楼主的质粒好大,可能P出来了也有一些点突变了。
8楼2010-07-22 15:01:17
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


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引用回帖:
Originally posted by 沐风望野 at 2010-05-27 12:57:23:
我通过同源重组得到一个大约为27Kb的质粒,已经通过其他六种酶酶切验证过其正确性了,但是接下来用MunI和XbaI双酶切质粒时根本切不开,换用这两种酶分别单酶切也切不动质粒,请问可能是什么问题呢?

可能不是片段的问题,MunI这个酶切效率本来就低,如果你把它和XbaI双酶切的话,很可能就切不开。分步酶切试一试吧
9楼2010-07-22 15:15:37
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)

现在一直就是在分步酶切,可是XbaI能切开,MunI切不开,会不会是位点发生了突变呢
10楼2010-07-23 09:03:45
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