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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么酶切总是切不开？
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么酶切总是切不开？ 已有11人参与

我通过同源重组得到一个大约为27Kb的质粒，已经通过其他六种酶酶切验证过其正确性了，但是接下来用MunI和XbaI双酶切质粒时根本切不开，换用这两种酶分别单酶切也切不动质粒，请问可能是什么问题呢？
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1楼 2010-05-27 12:57:23
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:28
楼主的质粒好大啊~
可以试试加大酶量，要不可以在网上查查相关的大片段质粒如何有效酶切的？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-05-27 14:09:50
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catherine_

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:39
我k...
你用这么大的质粒有啥用啊！！！
xbaI 单酶都切不动。。。你确信这个质粒的序列没问题？
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3楼2010-05-27 14:16:56
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-27 14:46:48
很明显，质粒序列突变了，或者甲基化了。，我经常遇见，正好是要用的酶切位点有变化，唉～
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4楼2010-05-27 14:35:32
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jingcp200320

银虫 (小有名气)
可以测序 看看你这两个酶切位点附近是否发生了碱基突变！
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5楼2010-05-27 16:09:50
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)
我用这么大的质粒是为了做异源表达用的，之前曾经酶切正确过，难道保藏的菌种之后质粒的碱基序列也会发生突变吗？
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6楼2010-07-22 11:14:31
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢交流，欢迎常来~~ 2010-07-23 11:23:57
用Xba1时一定要注意甲基化的问题，一些大肠的Dam甲基化酶可以识别GATC序列中的腺嘌呤，N6，并使其甲基化。这样一些限制酶，如Bcl1,Xba1等就切不开了。
我以前遇到过这样问题，费了大力气都切不开。
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7楼2010-07-22 11:23:49
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bigbangrex

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
很可能是甲基化造成的，我听说有人把整个质粒都P出来再用一个酶把甲基化质粒切碎后再酶切就切得动了。可是楼主的质粒好大，可能P出来了也有一些点突变了。
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8楼2010-07-22 15:01:17
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by 沐风望野 at 2010-05-27 12:57:23:
我通过同源重组得到一个大约为27Kb的质粒，已经通过其他六种酶酶切验证过其正确性了，但是接下来用MunI和XbaI双酶切质粒时根本切不开，换用这两种酶分别单酶切也切不动质粒，请问可能是什么问题呢？

可能不是片段的问题，MunI这个酶切效率本来就低，如果你把它和XbaI双酶切的话，很可能就切不开。分步酶切试一试吧
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9楼2010-07-22 15:15:37
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)
现在一直就是在分步酶切，可是XbaI能切开，MunI切不开，会不会是位点发生了突变呢
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10楼2010-07-23 09:03:45
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