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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 影响酶切的几个主要因素
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panda73

金虫 (小有名气)

[交流] 影响酶切的几个主要因素已有7人参与

影响酶切的几个主要因素：
1. 质粒DNA的质量
1）质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性
1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量
1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php

[ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ]
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1楼2012-02-27 16:40:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

酶切专家

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
这才是专家，惭愧，惭愧
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2楼2012-02-28 10:57:03
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十口心思

木虫 (小有名气)
★
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西瓜(金币+2): 鼓励交流！ 2012-02-29 18:21:02
如果是你自己总结的经验，可以交流下。如果你用TAKARA酶以及建库就要另当别论了，我之前建库，挑了几百个克隆进行测序和酶切验证，都连进去了，认为是百分之百。后来几次扩库后，便出现空载体。说明还是没切干净，只不过几率比较低，大概再万分之一，你挑几十个克隆验证根本看出来。不过不影响库质量。用得水也挺有关系，当时我试了很多水，发现用我们自己蒸馏出的三蒸水似乎要好于Miniipore18兆欧的水。
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5楼2012-02-29 11:03:03
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普通回帖

十口心思

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-02-29 08:18:11
得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的质粒，纯度都还不错。还有是任何生物反应不可能达到完全，酶切反应不能实现完全酶切的，无论你怎么优化。金无足赤。
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3楼2012-02-29 01:11:50
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panda73

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 十口心思 at 2012-02-29 01:11:50:
得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的 ...

做一个克隆是可以无所谓，一周不行，可以两周，甚至三周时间去做。但如果要做很多个克隆呢，或者想建一个高质量的库呢。
当然，这些只是交流，仅供参考
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4楼2012-02-29 09:53:34
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馋猫

银虫 (小有名气)
★
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1949stone: 这个品牌的我感觉有点问题 不知道为啥 2012-02-29 18:44:14
fermentas那个网站也有，你看你的酶的说明书，其实你加入的都是远远过量的
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6楼2012-02-29 17:34:53
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馋猫

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 馋猫 at 2012-02-29 17:34:53:
fermentas那个网站也有，你看你的酶的说明书，其实你加入的都是远远过量的

个人感觉吧，
TAKARA我感觉是最水的，不过也是最便宜
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7楼2012-03-05 13:52:43
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
其实没那么多的讲究，加多了用的是NEB的HF也不用考虑星号活性的问题，挺好的，做个酶切实验别太纠结，如果有空载用CIP或者热敏磷酸酶就解决了，Takara的就算了，不在考虑范围内。
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8楼2012-03-05 16:02:50
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xlchangbin

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
已经开始收费了呀
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净化学术环境，实事求是！
9楼2012-03-05 16:35:01
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panda73

金虫 (小有名气)
还是可以免费试用的，依然很方便
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10楼2012-03-05 21:56:30
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