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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
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zhoubin0823

木虫 (小有名气)

[求助] 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助

我用的表达载体是pMAL-c5X,选的酶切位点是NdeⅠ与NotⅠ，T载体用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T载体与目的基因连上了，测序正确，分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌，怎么回事？求高手解答。期间做过一些对照试验：
1：用未酶切的质粒pMAL-c5X转化感受态可以得到大量单菌落，以此排除感受态问题。
2：分别用连接酶连接双酶切的pMAL-c5x与连接目的基因的T载体，结果显示不长单菌落，以此排除酶切不充分。
3：实验室的连接酶其他同学成功连接过，也可以排除连接酶的问题。
那么是因为目的基因片段太大，难以连接吗？求解答！！！
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1楼 2013-06-08 21:06:15
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhoubin0823(myprayer代发): 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-09 08:48:36
一、2.2kb的片段应该不大，不知道pMAL-c5X载体多大，这个载体好像不是很常见呐。
二、”分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌“，没有载体图，也不知道切下来的片段多大，我想你应该知道根据不同大小去进行胶回收纯化或PCR产物纯化吧。
三、连接的比例1:2~1:5是指摩尔比，要考虑片段大小的，这个建议参考TaKaRa pMD18、19T Vector 说明书中算法。一般做得多的话，都是直接根据电泳条带亮度做相应调整。如果样品浓度低，可以不加水，增大反应体系。
四、一般片段较长，连接时间相应也较长，不同公司的ligase给的参考条件不一样，建议16℃过夜。
五、酶切时间按照说明书来，不是时间越长越好，有些酶长时间incubator会有星活性。
最后，突然发现我们用户名挺像
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2013-06-08 21:53:57
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zhoubin0823

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-08 21:53:57
一、2.2kb的片段应该不大，不知道pMAL-c5X载体多大，这个载体好像不是很常见呐。
二、”分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌“，没有载体图，也 ...

一、pMAL-c5X载体大小为5700bp，是带有MBP标签的载体。
二、目的基因2200bp，载体5700bp。
三、连接时一般是看酶切后电泳的亮度，纯化后电泳基本上看不到，不太好判断。
四、我也是16°C过夜连接的。
五、我都是过夜酶切，怕切不开，之前就有没切开过的经历。
谢谢你的建议，我会去注意这些，呵呵，用户名挺像可能是我和你的名字差不多吧！
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3楼2013-06-11 10:47:51
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linhehu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-11 21:12:31
双酶切的话，如果有些酶难切，最好分部酶切，先用难切的酶线性化载体和目的片段，纯化后再进行容易的酶线性化载体和片段。如果载体线性化好的话，那连接几乎是没问题的。而且连接的转化做好把细菌都离心下来，全部涂板。这个是我经常构建载体的经验
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在知识的海洋里裸泳
4楼2013-06-11 19:27:02
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六月青予

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

2200bp不是很常，可以把insert的pcr产物跑胶，看是否有非特异性条带，另外，可以尝试其他感受态细菌，菌种对不一样的质粒转化效率是不同的
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至少做到没有遗憾
5楼2013-06-11 21:52:30
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
zhoubin0823(myprayer代发): 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-14 08:15:18
你先把回收的片段跑胶看看确定浓度以及有没有会受到，如果都没问题的话，我不知道你连接体系用的多大，我一般是10uL的连接体系，除了酶和buffer外其余全加连接片段，一般载体加1 uL，其余就是插入基因了。
实在不行，你问问你们实验室有没有人用这个载体构建出来过质粒，有的话问他要一点切一下做载体，这个能确保切得完全。
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在等待中涅槃重生
6楼2013-06-11 23:15:59
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zhoubin0823

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 六月青予 at 2013-06-11 21:52:30
2200bp不是很常，可以把insert的pcr产物跑胶，看是否有非特异性条带，另外，可以尝试其他感受态细菌，菌种对不一样的质粒转化效率是不同的

insert与pcr产物跑胶基本看不到条带了，只有一点点的印记。尝试过JM109与DH5α，这两个应该是最常用的，还需要试试其他的吗？
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7楼2013-06-13 10:10:13
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zhoubin0823

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by linhehu at 2013-06-11 19:27:02
双酶切的话，如果有些酶难切，最好分部酶切，先用难切的酶线性化载体和目的片段，纯化后再进行容易的酶线性化载体和片段。如果载体线性化好的话，那连接几乎是没问题的。而且连接的转化做好把细菌都离心下来，全部涂 ...

分步切也试过，只是第二步酶切时条带就只有一点点印记，再割胶纯化基本不会有东西了吧？怎么去评估载体的线性化比较好？连接的转化都是离心过的！
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8楼2013-06-13 10:13:43
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zhoubin0823

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yuxia82012 at 2013-06-11 23:15:59
你先把回收的片段跑胶看看确定浓度以及有没有会受到，如果都没问题的话，我不知道你连接体系用的多大，我一般是10uL的连接体系，除了酶和buffer外其余全加连接片段，一般载体加1 uL，其余就是插入基因了。
实在不行 ...

我一般也是用10 ul的体系，加过载体：基因为 1:7 和 2:6 的，都没有加水。
别人构建的质粒我拿来也是一样要切的，且切的难度也是一样的。
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9楼2013-06-13 10:20:13
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linhehu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhoubin0823 at 2013-06-13 10:13:43
分步切也试过，只是第二步酶切时条带就只有一点点印记，再割胶纯化基本不会有东西了吧？怎么去评估载体的线性化比较好？连接的转化都是离心过的！...

质粒完全酶切完后可以直接用试剂盒回收，并不用割胶回收，加入质粒的量就不会减少多少了。
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在知识的海洋里裸泳
10楼2013-06-13 14:28:37
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