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amilie030312

金虫 (正式写手)

你用的是哪家公司的连接酶?我们正常情况下时室温15分钟就可以了。不过你们的两个酶片段末端一个是2个碱基突出一个是4个碱基突出的,两边的连接效率应该是不一样的,所以难连一些。平常我做这种两个末端不均一的一般是做定向克隆,不过都是一个平末端一个粘端,按理说你这个应该不至于有一个平末端一个粘端难连啊。你试试室温1-2小时,干嘛16度过夜啊。
摩尔比确实像上面说的还要看片段长短的,但是我偷懒的做法就是少加些插入目的片段能相应提升连接效率。
11楼2013-06-13 15:49:06
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得主要原因是你酶切之后回收回来的片段浓度太低的原因,你最好是多酶切几管,保证最后回收回来的量,再做连接
12楼2013-06-13 16:01:59
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhoubin0823 at 2013-06-12 21:20:13
我一般也是用10 ul的体系,加过载体:基因为 1:7 和 2:6 的,都没有加水。
别人构建的质粒我拿来也是一样要切的,且切的难度也是一样的。...

切的难度是一样的,但是问题是别人构建好了里面插入基因了,切开的话跑胶看会很明显,你直接用空质粒切,单切和双切跑胶出来看不出区别的,做这个的目的只是为了确保载体是完全切开的。另外回收完的片段一定要跑胶看看确保都回收到了
在等待中涅槃重生
13楼2013-06-13 22:24:45
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hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换方法 实在不行,用in fusion 的方法 很简单的,去网上看 买试剂盒
不懈
14楼2013-09-03 13:53:15
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoubin0823 at 2013-06-11 10:47:51
一、pMAL-c5X载体大小为5700bp,是带有MBP标签的载体。
二、目的基因2200bp,载体5700bp。
三、连接时一般是看酶切后电泳的亮度,纯化后电泳基本上看不到,不太好判断。
四、我也是16°C过夜连接的。
五、我都 ...

光看这里我就觉得你连不上了,我们有专门的仪器测浓度,纯化后基本低到5ng/ul的浓度都能测出来,我一般跑50ng,这时电泳图上都是有条带,而你这个纯化都没条带估计就不好连,我的5ng/ul都不好连,一般提高到10多ng,就非常好连
建议你大体系酶切,大孔上样,切胶回收
回收浓度非常关键
15楼2013-09-03 17:39:32
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