应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
152/2返回列表上一页12
查看: 3054  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

amilie030312

金虫 (正式写手)
你用的是哪家公司的连接酶？我们正常情况下时室温15分钟就可以了。不过你们的两个酶片段末端一个是2个碱基突出一个是4个碱基突出的，两边的连接效率应该是不一样的，所以难连一些。平常我做这种两个末端不均一的一般是做定向克隆，不过都是一个平末端一个粘端，按理说你这个应该不至于有一个平末端一个粘端难连啊。你试试室温1-2小时，干嘛16度过夜啊。
摩尔比确实像上面说的还要看片段长短的，但是我偷懒的做法就是少加些插入目的片段能相应提升连接效率。
赞一下 回复此楼
11楼2013-06-13 15:49:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得主要原因是你酶切之后回收回来的片段浓度太低的原因，你最好是多酶切几管，保证最后回收回来的量，再做连接
赞一下 回复此楼
12楼2013-06-13 16:01:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhoubin0823 at 2013-06-12 21:20:13
我一般也是用10 ul的体系，加过载体：基因为 1:7 和 2:6 的，都没有加水。
别人构建的质粒我拿来也是一样要切的，且切的难度也是一样的。...

切的难度是一样的，但是问题是别人构建好了里面插入基因了，切开的话跑胶看会很明显，你直接用空质粒切，单切和双切跑胶出来看不出区别的，做这个的目的只是为了确保载体是完全切开的。另外回收完的片段一定要跑胶看看确保都回收到了
赞一下 回复此楼
在等待中涅槃重生
13楼2013-06-13 22:24:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换方法 实在不行，用in fusion 的方法 很简单的，去网上看 买试剂盒
赞一下 回复此楼
不懈
14楼2013-09-03 13:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoubin0823 at 2013-06-11 10:47:51
一、pMAL-c5X载体大小为5700bp，是带有MBP标签的载体。
二、目的基因2200bp，载体5700bp。
三、连接时一般是看酶切后电泳的亮度，纯化后电泳基本上看不到，不太好判断。
四、我也是16°C过夜连接的。
五、我都 ...

光看这里我就觉得你连不上了，我们有专门的仪器测浓度，纯化后基本低到5ng/ul的浓度都能测出来，我一般跑50ng，这时电泳图上都是有条带，而你这个纯化都没条带估计就不好连，我的5ng/ul都不好连，一般提高到10多ng，就非常好连
建议你大体系酶切，大孔上样，切胶回收
回收浓度非常关键
赞一下 回复此楼
15楼2013-09-03 17:39:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhoubin0823 的主题更新
152/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭