| 查看: 3698 | 回复: 14 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
zhoubin0823木虫 (小有名气)
|
[求助]
纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
|
|
|
我用的表达载体是pMAL-c5X,选的酶切位点是NdeⅠ与NotⅠ，T载体用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T载体与目的基因连上了，测序正确，分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌，怎么回事？求高手解答。期间做过一些对照试验： 1：用未酶切的质粒pMAL-c5X转化感受态可以得到大量单菌落，以此排除感受态问题。 2：分别用连接酶连接双酶切的pMAL-c5x与连接目的基因的T载体，结果显示不长单菌落，以此排除酶切不充分。 3：实验室的连接酶其他同学成功连接过，也可以排除连接酶的问题。 那么是因为目的基因片段太大，难以连接吗？求解答！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有141人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
-
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
yuxia82012
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 4980
- 散金: 2225
- 红花: 2
- 帖子: 1340
- 在线: 426.5小时
- 虫号: 781881
- 注册: 2009-05-29
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
13楼2013-06-13 22:24:45
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
zhoubin0823(myprayer代发): 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-09 08:48:36
感谢参与，应助指数 +1
zhoubin0823(myprayer代发): 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-09 08:48:36
|
一、2.2kb的片段应该不大，不知道pMAL-c5X载体多大，这个载体好像不是很常见呐。 二、”分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌“，没有载体图，也不知道切下来的片段多大，我想你应该知道根据不同大小去进行胶回收纯化或PCR产物纯化吧。 三、连接的比例1:2~1:5是指摩尔比，要考虑片段大小的，这个建议参考TaKaRa pMD18、19T Vector 说明书中算法。一般做得多的话，都是直接根据电泳条带亮度做相应调整。如果样品浓度低，可以不加水，增大反应体系。 四、一般片段较长，连接时间相应也较长，不同公司的ligase给的参考条件不一样，建议16℃过夜。 五、酶切时间按照说明书来，不是时间越长越好，有些酶长时间incubator会有星活性。 最后，突然发现我们用户名挺像 |
2楼2013-06-08 21:53:57
zhoubin0823
木虫 (小有名气)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 3771.7
- 散金: 30
- 红花: 2
- 帖子: 223
- 在线: 230.1小时
- 虫号: 1421944
- 注册: 2011-09-29
- 性别: MM
- 专业: 蛋白质组学
3楼2013-06-11 10:47:51
4楼2013-06-11 19:27:02
