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zhoubin0823木虫 (小有名气)
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纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
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我用的表达载体是pMAL-c5X,选的酶切位点是NdeⅠ与NotⅠ，T载体用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T载体与目的基因连上了，测序正确，分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌，怎么回事？求高手解答。期间做过一些对照试验： 1：用未酶切的质粒pMAL-c5X转化感受态可以得到大量单菌落，以此排除感受态问题。 2：分别用连接酶连接双酶切的pMAL-c5x与连接目的基因的T载体，结果显示不长单菌落，以此排除酶切不充分。 3：实验室的连接酶其他同学成功连接过，也可以排除连接酶的问题。 那么是因为目的基因片段太大，难以连接吗？求解答！！！ |
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zhoulubin
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一、2.2kb的片段应该不大，不知道pMAL-c5X载体多大，这个载体好像不是很常见呐。 二、”分别将表达载体与连上目的基因的T载体双酶切后，分别按载体：目的基因为1:7、2:6的比例连接，就是没有长菌“，没有载体图，也不知道切下来的片段多大，我想你应该知道根据不同大小去进行胶回收纯化或PCR产物纯化吧。 三、连接的比例1:2~1:5是指摩尔比，要考虑片段大小的，这个建议参考TaKaRa pMD18、19T Vector 说明书中算法。一般做得多的话，都是直接根据电泳条带亮度做相应调整。如果样品浓度低，可以不加水，增大反应体系。 四、一般片段较长，连接时间相应也较长，不同公司的ligase给的参考条件不一样，建议16℃过夜。 五、酶切时间按照说明书来，不是时间越长越好，有些酶长时间incubator会有星活性。 最后，突然发现我们用户名挺像 |
2楼2013-06-08 21:53:57
zhoubin0823
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yuxia82012
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你先把回收的片段跑胶看看确定浓度以及有没有会受到，如果都没问题的话，我不知道你连接体系用的多大，我一般是10uL的连接体系，除了酶和buffer外其余全加连接片段，一般载体加1 uL，其余就是插入基因了。 实在不行，你问问你们实验室有没有人用这个载体构建出来过质粒，有的话问他要一点切一下做载体，这个能确保切得完全。 |
6楼2013-06-11 23:15:59
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