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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何做分步双酶切
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 如何做分步双酶切 已有6人参与

第一个酶切完跑胶回收？那岂不是浓度会很降低？不跑胶回收的话，热失活完直接加第二种酶？那与之对应的buffer怎么加呢？请赐教！！！！越详细越好！！！！
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1楼 2013-09-10 21:09:02
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
★
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第一个酶切完之后，用酚和氯仿抽提 ；
醇沉
风干后再第二个酶切
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2楼2013-09-10 22:32:09
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-11 11:48:26
1.明确你酶切的是什么。载体？还是PCR产物？
载体:酚/氯仿抽提或核酸纯化试剂盒回收，这样回收效率应该比胶回收高。然后再进行下一步单酶切，纯化试剂盒或胶回收。
PCR产物:跑胶，若无二聚体，核酸纯化试剂盒回收比较好，当然，无论有无二聚体，胶回收肯定都没有问题。然后，分步单酶切与载体相同操作，酚/氯仿或试剂盒。纯化试剂盒一定要注意，要弄清楚能回收多大的片段。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by ykluuniu on 2013-9-10 at 22:56 ]
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3楼2013-09-10 22:54:49
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因为吃饭

银虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-11 11:48:31
我最近刚做的双酶切，因为有种酶没有了，订货要很久，就换了另外一个公司的，但是buffer不一样，也是分开切的。我就是第一次切完，然后用试剂盒纯化，再做第二次酶切，然后再切胶回收。
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辩证。
4楼2013-09-11 08:25:26
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七魂0330

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 因为吃饭 at 2013-09-11 08:25:26
我最近刚做的双酶切，因为有种酶没有了，订货要很久，就换了另外一个公司的，但是buffer不一样，也是分开切的。我就是第一次切完，然后用试剂盒纯化，再做第二次酶切，然后再切胶回收。

请问用的什么试剂盒纯化？
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5楼2014-10-06 15:20:34
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zergbloody

铁虫 (正式写手)
★
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推荐使用快切酶 现在基本都是通用buffer 很方便的 祝好！

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6楼2014-10-07 08:19:08
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★
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现在有纯化试剂盒，不用经过跑胶。实在不行还有乙醇沉淀法，木虫里有方法，自己搜一下

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天道酬勤
7楼2014-10-07 10:22:21
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