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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分步酶切 回收不到片段
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wa99999999

新虫 (初入文坛)

[求助] 分步酶切 回收不到片段

要用Apa I 和Xho I 酶切，用的是宝生物公司的酶，由于没有通用Buffer,就分步酶切，先用Apa  I: Apa I    1ul
                        10xH buffer  2ul
                        DNA          17ul
37度 2小时
      全部电泳 切胶回收，效果可以
   再用Xho I  切 条件一样，但是 回收的时候 回收不到片段，是什么原因啊？请个位大虾帮忙！  
    我不想分步酶切了，想直接双酶切，但是没有通用Buffer,怎么办？自己配可以吗？ 怎么配 ？说说 具体 谢谢了
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1楼 2012-09-24 22:16:13
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-25 14:23:52
wa99999999: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-25 17:21:41
酶的说明书上有BUFFER说明，推荐的是最适BUFFER，效率在100%，其他BUFFER也可以用的，只不过效率有的只能达到75%。不知道LZ双酶切DNA量是多少，而且建议LZ分布酶切，中间不要切胶回收，简单的DNA 纯化就行（天跟盒子），双酶切后在切胶回收，回收率好一点。总之最好的办法就是加大DNA的量。
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2楼2012-09-24 23:02:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-25 14:24:03
wa99999999: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-25 17:21:54
xhoI好像在各种buffer的效果都不错，你查一下，应该可以有通用Buffer。我用的酶是从NEB买的，双切就用NEB Buffer3。还有，即使有的条件酶切效率不是100%，适当加大酶的用量也可以切得不错。如果你一定要分步切，多回收一次肯定损失会多一些，加大DNA量就行了。
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3楼2012-09-25 07:48:19
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-25 14:24:14
wa99999999: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-09-25 17:22:06
分布酶切两次胶回收，损失率惨不忍睹，建议最好不要两次胶回收，第一次单酶切之后，可以考虑跑一点点验证切开没，剩下的直接乙醇沉淀法回收，损失绝对比胶回收少，第二次酶切就可以胶回收了的，总之切的量尽量大一点！
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-09-25 08:43:42
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wa99999999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-09-25 08:43:42
分布酶切两次胶回收，损失率惨不忍睹，建议最好不要两次胶回收，第一次单酶切之后，可以考虑跑一点点验证切开没，剩下的直接乙醇沉淀法回收，损失绝对比胶回收少，第二次酶切就可以胶回收了的，总之切的量尽量大一点 ...

终于回收到了
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5楼2012-10-11 21:07:59
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