应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题
141/2返回列表12下一页
查看: 2303  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

qurande

金虫 (小有名气)

[求助] 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题

129bp的小片段连接到pGEM-T载体上之后，菌落pcr鉴定条带正确，测序序列正确并且专门在测序结果中search过引物序列也正确

酶切体系  质粒          12ul(大约100ng/ul)
           bufferD           2.5ul
             nde1             0.9ul     （promega的内切酶）
               sal1             0.9ul  
            补水到25ul    37度  4h   做两管反应，浓缩

然后跑2%的琼脂糖胶 两管酶切产物在一个胶空里跑电泳  当100bp的marker能分清条带的时候，却看不见目的条带

后来我有小量的双酶切试了试，质粒3ul ，内切酶分别用0.2ul，10ul体系酶切2h，还是没有出现目的条带
希望高手给出指点啊
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-06-01 08:42:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:10:10
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 08:42:01:
129bp的小片段连接到pGEM-T载体上之后，菌落pcr鉴定条带正确，测序序列正确并且专门在测序结果中search过引物序列也正确

酶切体系  质粒          12ul(大约100ng/ul)
           bufferD           2.5ul
...

先把链接的载体电泳下看看有没有连接上（以pGEM-T载体为对照）连接上了说明就是酶切的问题，先把第一步确认好再说，连接上了，那就再调整酶切体系~PCR正确只是确定你扩增到了目的片段，但你连接的问题还没有确定~
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-06-01 08:51:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qurande(金币+1): 谢谢你的建议 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
首先，小片段在胶里的染色信号要弱一些，有可能看不到，建议不要在配胶的时候加EB，而是电泳结束后用EB去染。
其次，你在大切前是应该做小切去确定酶切条件的，先大切失败然后想到小切是满痛的一个教训，你老板知道估计要发飙吧。
最后，小切验证是要有很多control的，这样才便于分析，同时切你自己的样品和别人的已经酶切成功过的样品作为对比，切的时候除了双切之外还要分别做单切，跑胶的时候每个样品都有四个lane分别是切前，单切，单切，双切，这样才能分析出问题出在哪里。
还有有的时候某个公司的酶针对某个载体就是不好用，那不妨换另一个公司的试试，我们实验室常用的酶都是有好几个公司的stock的。
赞一下(1人) 回复此楼
摒气动方息，宁神心自明。
3楼2011-06-01 09:12:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

忘记说了，小切的话你用3ul有点少，至少要保证0.5mg，这样电泳才能看到带
赞一下 回复此楼
摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-06-01 09:13:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
qurande(金币+5): 说的很到位谢谢 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
看不到条带很正常，原因如下：
1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp，你的片段为130bp左右，那么载体和片段的分子量之比是23:1。
2.你酶切时质粒的量约为1200ng，即1.2ug，不知道这个浓度是你测的还是估算的，保守点的话在1ug左右
3.假定EB显色的机理你都明白，那么酶切完跑胶后片段的亮度应为载体亮度的二十三分之一，片段的质量约为1000/23约为40ng，其实加上其他的一些损失误差之类的，很可能到不了这个量
4.你用的mark每条带都有一个浓度，乘上你加的体积就算这条带出质量了
建议：1.小片段直接用引物扩增后使用，尽量不要通过酶切来获得，即使跑胶能看到，回收效率也很低，这个你该懂
2.如果执意要酶切获得，只有多切些质粒
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-06-01 10:14:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:14:00:
看不到条带很正常，原因如下：
1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp，你的片段为130bp左右，那么载体和片段的分子量之比是23:1。
2.你酶切时质粒的量约为1200ng，即1.2ug，不知道这个浓度是你测的还是估算的，保守点 ...

小片段直接用引物扩增后使用 怎么使用啊，我要连接另一个载体，需要粘性末端，另外，pcr产物我直接双酶切   连载体没有成功，上网查到说是我用的两个酶不仅仅需要它专用的酶切位点，还需要一段酶切位点前面的序列来帮助内切酶作用到酶切位点上去
赞一下 回复此楼
6楼2011-06-01 10:32:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 18:56:33
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 10:32:46:
小片段直接用引物扩增后使用 怎么使用啊，我要连接另一个载体，需要粘性末端，另外，pcr产物我直接双酶切   连载体没有成功，上网查到说是我用的两个酶不仅仅需要它专用的酶切位点，还需要一段酶切位点前面的序 ...

要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面加上保护碱基后去扩增片段，扩完后就可以酶切使用了
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
7楼2011-06-01 10:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:56:07:
要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面 ...

pcr产物酶切完毕需要纯化或者跑胶切胶回收么？
赞一下 回复此楼
8楼2011-06-01 11:54:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:56:07:
要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面 ...

悲剧了，我选的两个酶上游nde1  下游 sal1 都需要很长的保护碱基，我的都只有3个啊~~~
赞一下 回复此楼
9楼2011-06-01 12:11:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 12:11:38:
悲剧了，我选的两个酶上游nde1  下游 sal1 都需要很长的保护碱基，我的都只有3个啊~~~



重新设计引物吧，或者酶切的时候多加些质粒
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2011-06-01 22:05:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 qurande 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 5/250 2026-08-04 09:27 by v1TJC4qJauAB
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 10/500 2026-08-04 09:26 by v1TJC4qJauAB
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 9/450 2026-08-04 09:17 by v1TJC4qJauAB
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 10/500 2026-08-04 09:15 by v1TJC4qJauAB
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +12 winnerche 2026-07-29 16/800 2026-08-04 08:18 by Equinoxhua
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 9/450 2026-08-04 07:37 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 13/650 2026-08-04 07:30 by k7OM8YghWbkC
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +9 锦衣卫寒战 2026-07-28 13/650 2026-08-04 07:21 by Ermito
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 6/300 2026-08-04 06:10 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 6/300 2026-08-04 04:47 by k7OM8YghWbkC
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 7/350 2026-08-04 04:46 by k7OM8YghWbkC
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 03:21 by k7OM8YghWbkC
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
[高分子] UV压敏胶开发 +3 ichall 2026-07-30 5/250 2026-08-03 14:40 by Sunrisepay
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +19 低垂的野花 2026-07-31 25/1250 2026-08-03 09:25 by gy116024
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +16 布布和一二 2026-07-30 22/1100 2026-08-03 09:20 by gy116024
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +15 wangze12014 2026-07-28 19/950 2026-08-02 20:05 by 蔡棒棒菂
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭