应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pGEM-T Easy载体的相关问题-讨论
81/1返回列表
查看: 2208  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

475502411

铜虫 (著名写手)

[交流] pGEM-T Easy载体的相关问题-讨论

大家出来讨论一下吧：
细菌的某个基因发生改变，要看它对细菌其他基因表达水平的影响，就需要将未突变的这段基因连接到载体上，在将其转入存在突变的菌体内，对比转化前后的不同，而得出结论。本实验室没有做过相关实验，请各位说说该实验的难易？注意事项？关键环节？连接体系........
谢谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zhouying_613

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-06-08 11:05:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhouying_613

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
1949stone(金币+1): 鼓励交流 2011-06-08 16:17:17
475502411(金币+1): 2011-06-08 17:18:08
实验流程很容易，但是不知道和你的标题T-vector有啥关系？
而且如果是我设计实验，我肯定是拿突变菌株和野生型做比较，看你要研究的那几个基因的表达差异。你这是要做恢复突变，确认表型的吧？
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-06-08 12:15:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
475502411(金币+1): 2011-06-08 17:18:15
是啊，你标题上的载体是做克隆用的，不是做表达用的哦。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-06-08 13:20:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-06-08 14:44:24
475502411(金币+5): 2011-06-08 16:29:59
这个比较容易做。。。
首先你要先将目的基因（就是你要检测该基因是否在突变体中的表达发生变化了）和载体连接上，当然这个是连接问题了，连接我觉得楼主应该没有什么问题吧？

其实验证连接好之后，将重组载体转化进突变体中，同时将该重组载体转化进野生型菌中，然后对比两个重组载体上的目的基因的表达是否发生变化，当然了，这个后期检测可以用发光，表达量等等来检测。。。

其实还有另外一种方法可以达到楼主的需要，就是DNA microassay.你可以将你的突变体的mRNA提取出来，然后反转录成cDNA,然后交由生物公司做一个基因芯片，这样你就会知道你的突变体里面哪些基因的表达发生变化了，就方便你寻找整调节或者负调节的基因了。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-06-08 14:25:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 14:25:04:
这个比较容易做。。。
首先你要先将目的基因（就是你要检测该基因是否在突变体中的表达发生变化了）和载体连接上，当然这个是连接问题了，连接我觉得楼主应该没有什么问题吧？

其实验证连接好之后，将重组载体 ...

谢谢您，我才开始设计实验，还没有开始做，想跟大家取取经，省的走太多的弯路。想问一下问题：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用进行加尾A反应了？
2.连接是，连接时目的基因和载体的摩尔比是3:1-1:3，那目的DNA的魔都怎么确定呢？
3.将重组质粒转入临床分离株（含突变位点）时，有哪些转化方法？
谢谢您，初次做，望多指教！！！
赞一下 回复此楼
5楼2011-06-08 16:29:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
475502411(金币+5): 2011-06-08 17:11:10
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-06-08 16:29:34:
谢谢您，我才开始设计实验，还没有开始做，想跟大家取取经，省的走太多的弯路。想问一下问题：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用进行加尾A反应了？
2.连接是，连接时目的基因和载体的摩尔比是3:1 ...

1：这个没有什么关系吧，我们一般都是直接设计引物进行扩增，然后连接的。。。

2：连接的时候首先根据你酶切的基因和酶切的基因跑出来的电泳图，定量看看，如果亮的话可以少加一些，反之亦然；当然了，一般连接的时候目的基因要比载体多一些的。。。

3：转化方法就那么两种，化学法或者电转化嘛。。。电转个人认为好一点，省力省时。。。我们也一直是电转。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-06-08 16:45:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 16:45:03:
1：这个没有什么关系吧，我们一般都是直接设计引物进行扩增，然后连接的。。。

2：连接的时候首先根据你酶切的基因和酶切的基因跑出来的电泳图，定量看看，如果亮的话可以少加一些，反之亦然；当然了，一般 ...

目的基因和pGEM-T Easy在题的连接不用酶切吧？我直接将PCR产物纯化，跑胶看亮度如何来切丁它的量？不用具体定量吗？我看说明书上说有。谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2011-06-08 17:10:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhouying_613 at 2011-06-08 12:15:18:
实验流程很容易，但是不知道和你的标题T-vector有啥关系？
而且如果是我设计实验，我肯定是拿突变菌株和野生型做比较，看你要研究的那几个基因的表达差异。你这是要做恢复突变，确认表型的吧？

1.我刚开始做第一步目的基因和载体的连接，接这样写了，不妥之处见谅
2.我做的是菌株某一基因突变后对菌体耐药，毒力的影响。想将野生型的这段基因通过载体重新转入突变株，看转入前后菌株各方面的变化，以确定该突变对菌株的影响。
实验设计用该合理吧？请指教
赞一下 回复此楼
8楼2011-06-08 17:17:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 475502411 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-29 19:27 by cqwQDCxMcL3I
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:54 by yCO1Ll7aHtsw
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:47 by yCO1Ll7aHtsw
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:37 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:30 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:03 by etmYJ6d2rquH
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 15:46 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 15:04 by etmYJ6d2rquH
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:41 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:30 by etmYJ6d2rquH
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:24 by etmYJ6d2rquH
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:13 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 7/350 2026-09-29 14:07 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-29 13:56 by etmYJ6d2rquH
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-29 09:49 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 18:51 by 9lS3ad5oOymn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭