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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pGEM-T Easy载体的相关问题-讨论
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475502411

铜虫 (著名写手)

[交流] pGEM-T Easy载体的相关问题-讨论

大家出来讨论一下吧：
细菌的某个基因发生改变，要看它对细菌其他基因表达水平的影响，就需要将未突变的这段基因连接到载体上，在将其转入存在突变的菌体内，对比转化前后的不同，而得出结论。本实验室没有做过相关实验，请各位说说该实验的难易？注意事项？关键环节？连接体系........
谢谢！
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zhouying_613

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1楼 2011-06-08 11:05:02
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zhouying_613

新虫 (初入文坛)
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1949stone(金币+1): 鼓励交流 2011-06-08 16:17:17
475502411(金币+1): 2011-06-08 17:18:08
实验流程很容易，但是不知道和你的标题T-vector有啥关系？
而且如果是我设计实验，我肯定是拿突变菌株和野生型做比较，看你要研究的那几个基因的表达差异。你这是要做恢复突变，确认表型的吧？
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2楼2011-06-08 12:15:18
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
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475502411(金币+1): 2011-06-08 17:18:15
是啊，你标题上的载体是做克隆用的，不是做表达用的哦。
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3楼2011-06-08 13:20:12
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-06-08 14:44:24
475502411(金币+5): 2011-06-08 16:29:59
这个比较容易做。。。
首先你要先将目的基因（就是你要检测该基因是否在突变体中的表达发生变化了）和载体连接上，当然这个是连接问题了，连接我觉得楼主应该没有什么问题吧？

其实验证连接好之后，将重组载体转化进突变体中，同时将该重组载体转化进野生型菌中，然后对比两个重组载体上的目的基因的表达是否发生变化，当然了，这个后期检测可以用发光，表达量等等来检测。。。

其实还有另外一种方法可以达到楼主的需要，就是DNA microassay.你可以将你的突变体的mRNA提取出来，然后反转录成cDNA,然后交由生物公司做一个基因芯片，这样你就会知道你的突变体里面哪些基因的表达发生变化了，就方便你寻找整调节或者负调节的基因了。
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4楼2011-06-08 14:25:04
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 14:25:04:
这个比较容易做。。。
首先你要先将目的基因（就是你要检测该基因是否在突变体中的表达发生变化了）和载体连接上，当然这个是连接问题了，连接我觉得楼主应该没有什么问题吧？

其实验证连接好之后，将重组载体 ...

谢谢您，我才开始设计实验，还没有开始做，想跟大家取取经，省的走太多的弯路。想问一下问题：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用进行加尾A反应了？
2.连接是，连接时目的基因和载体的摩尔比是3:1-1:3，那目的DNA的魔都怎么确定呢？
3.将重组质粒转入临床分离株（含突变位点）时，有哪些转化方法？
谢谢您，初次做，望多指教！！！
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5楼2011-06-08 16:29:34
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
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475502411(金币+5): 2011-06-08 17:11:10
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-06-08 16:29:34:
谢谢您，我才开始设计实验，还没有开始做，想跟大家取取经，省的走太多的弯路。想问一下问题：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用进行加尾A反应了？
2.连接是，连接时目的基因和载体的摩尔比是3:1 ...

1：这个没有什么关系吧，我们一般都是直接设计引物进行扩增，然后连接的。。。

2：连接的时候首先根据你酶切的基因和酶切的基因跑出来的电泳图，定量看看，如果亮的话可以少加一些，反之亦然；当然了，一般连接的时候目的基因要比载体多一些的。。。

3：转化方法就那么两种，化学法或者电转化嘛。。。电转个人认为好一点，省力省时。。。我们也一直是电转。
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6楼2011-06-08 16:45:03
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 16:45:03:
1：这个没有什么关系吧，我们一般都是直接设计引物进行扩增，然后连接的。。。

2：连接的时候首先根据你酶切的基因和酶切的基因跑出来的电泳图，定量看看，如果亮的话可以少加一些，反之亦然；当然了，一般 ...

目的基因和pGEM-T Easy在题的连接不用酶切吧？我直接将PCR产物纯化，跑胶看亮度如何来切丁它的量？不用具体定量吗？我看说明书上说有。谢谢
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7楼2011-06-08 17:10:57
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhouying_613 at 2011-06-08 12:15:18:
实验流程很容易，但是不知道和你的标题T-vector有啥关系？
而且如果是我设计实验，我肯定是拿突变菌株和野生型做比较，看你要研究的那几个基因的表达差异。你这是要做恢复突变，确认表型的吧？

1.我刚开始做第一步目的基因和载体的连接，接这样写了，不妥之处见谅
2.我做的是菌株某一基因突变后对菌体耐药，毒力的影响。想将野生型的这段基因通过载体重新转入突变株，看转入前后菌株各方面的变化，以确定该突变对菌株的影响。
实验设计用该合理吧？请指教
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8楼2011-06-08 17:17:34
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