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【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑
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| T载体如果不跟PCR产物连接， 不是由于T末端，自己不能自连吗? 这样不应该lacZ基因中间断裂 不能表达吗? 为什么没有连接PCR产物的菌班是蓝色的呢？ |
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看天(金币+5): 鼓励回答！ 2011-03-07 11:21:08
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看天(金币+5): 鼓励回答！ 2011-03-07 11:21:08
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如果你们清楚T载体是怎么做出来的，就知道兰斑怎么来的了。 如果真的是两端都是T头，这个T载体是无法自连起来的。 但是为什么会有自连呢？是因为在制作T载体的过程中，除了两头是T的情况，不可避免的会还有一头是T突出，一头是平端（这个残留，但是也无法自连），或者两头是平端，或者是一头是T头，一头是A头，或者干脆就是微量的原始环状质粒无法完全分开，微量的环状原始质粒混在线性T载体成品里面。除了第一种情况一头T头，一头平端无法连接。其它几种情况加连接酶连接后，都会表现出环状的质粒，也就是蓝斑点了。至于为什么会混杂这几种东西，就牵涉到了基础的原理，和方法了，自己去查资料吧。 做T载体的工艺，就是尽可能的做到，全部是两头T头的载体，这样理论上就不会有篮斑了。但是这是不可能的，总会混杂上面几种情况造成蓝斑。混杂越多，蓝斑比例越多。也就是说明了T载体质量越差。这个是判断T载体好坏的一个最重要指标之一。 加T和酶切T载体的方法，没有可能达到100%不混杂上面几种情况。但是本公司做的T载体工艺，蓝色斑点小于10%，很多情况下小于5%，质量已经是达到顶级水平。其它公司很多工艺无法达到，就会出现较多的篮斑，或者两边T头掉了后，两端成了平端破坏读码框自连成白斑的假阳性情况。 |
4楼2011-03-07 11:19:54
5楼2011-03-07 11:21:50
6楼2011-03-07 11:26:55
7楼2011-03-07 11:31:09
★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
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建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~ 如果PCR产物插入了MCS位点，则LAZ基因被截断，不能表达，则克隆菌呈白色。 如果没插入MCS位点，而是自连的话，LAZ基因能表达，表达后产物与X-gal产生反应，变成蓝色蓝色。 T载体由于制作的问题，是会有自连得。如果没有自连的话 ，转入细菌，抗生素基因不能表达，细菌就不能在有抗生素的平板上生长。那么就不会产生菌落，产生了菌落的都是含有环形质粒的。 至于T载体为什么会自连，可以看下T载体是怎么生产的，一般都是用Eco5酶切出平末端，然后再平末端上加T尾，加T尾的效率并不是百分百的。 |
8楼2011-03-07 11:56:19
11楼2011-03-07 12:46:13
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天使托
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2011-03-07 12:32
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
zoujin12910楼
2011-03-07 12:38
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2011-03-07 12:48
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wg42315楼
2011-03-08 12:14
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