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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑

T载体如果不跟PCR产物连接， 不是由于T末端，自己不能自连吗? 这样不应该lacZ基因中间断裂 不能表达吗? 为什么没有连接PCR产物的菌班是蓝色的呢？
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1楼2011-03-07 09:55:27
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sunwei57

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换PMD18-T吧,稀释10倍取1ul做连接即可而且不用涂X-gal和IPTG,这是经验我们已经用了多年
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23楼2012-03-18 22:05:52
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普通回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
最近正在用这个载体，同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主，求解～
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2楼2011-03-07 10:12:02
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-03-07 10:12:02:
最近正在用这个载体，同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主，求解～

谢谢啦
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3楼2011-03-07 10:52:10
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yucheng9255

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看天(金币+5): 鼓励回答！ 2011-03-07 11:21:08
如果你们清楚T载体是怎么做出来的，就知道兰斑怎么来的了。

如果真的是两端都是T头，这个T载体是无法自连起来的。

但是为什么会有自连呢？是因为在制作T载体的过程中，除了两头是T的情况，不可避免的会还有一头是T突出，一头是平端（这个残留，但是也无法自连），或者两头是平端，或者是一头是T头，一头是A头，或者干脆就是微量的原始环状质粒无法完全分开，微量的环状原始质粒混在线性T载体成品里面。除了第一种情况一头T头，一头平端无法连接。其它几种情况加连接酶连接后，都会表现出环状的质粒，也就是蓝斑点了。至于为什么会混杂这几种东西，就牵涉到了基础的原理，和方法了，自己去查资料吧。

做T载体的工艺，就是尽可能的做到，全部是两头T头的载体，这样理论上就不会有篮斑了。但是这是不可能的，总会混杂上面几种情况造成蓝斑。混杂越多，蓝斑比例越多。也就是说明了T载体质量越差。这个是判断T载体好坏的一个最重要指标之一。

加T和酶切T载体的方法，没有可能达到100%不混杂上面几种情况。但是本公司做的T载体工艺，蓝色斑点小于10%，很多情况下小于5%，质量已经是达到顶级水平。其它公司很多工艺无法达到，就会出现较多的篮斑，或者两边T头掉了后，两端成了平端破坏读码框自连成白斑的假阳性情况。
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4楼2011-03-07 11:19:54
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yucheng9255 at 2011-03-07 11:19:54:
如果你们清楚T载体是怎么做出来的，就知道兰斑怎么来的了。

如果真的是两端都是T头，这个T载体是无法自连起来的。

但是为什么会有自连呢？是因为在制作T载体的过程中，除了两头是T的情况，不可避免的会还有 ...

那都是T头的载体 如果没有连接上PCR产物，不也应该是蓝斑吗？ 好困惑
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5楼2011-03-07 11:21:50
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genewind

金虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
你所说的PCR是指普通的Taq酶扩增的还是Pfu或者KOD扩的，如果是后者你要加A的！
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6楼2011-03-07 11:26:55
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by genewind at 2011-03-07 11:26:55:
你所说的PCR是指普通的Taq酶扩增的还是Pfu或者KOD扩的，如果是后者你要加A的！

为什么有两段T头 的载体不与PCR产物连接， 会出现蓝斑呢
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7楼2011-03-07 11:31:09
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~
如果PCR产物插入了MCS位点，则LAZ基因被截断，不能表达，则克隆菌呈白色。
如果没插入MCS位点，而是自连的话，LAZ基因能表达，表达后产物与X-gal产生反应，变成蓝色蓝色。

T载体由于制作的问题，是会有自连得。如果没有自连的话 ，转入细菌，抗生素基因不能表达，细菌就不能在有抗生素的平板上生长。那么就不会产生菌落，产生了菌落的都是含有环形质粒的。

至于T载体为什么会自连，可以看下T载体是怎么生产的，一般都是用Eco5酶切出平末端，然后再平末端上加T尾，加T尾的效率并不是百分百的。
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8楼2011-03-07 11:56:19
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cjlsl

金虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
哈哈
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11楼2011-03-07 12:46:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)
看得头都晕了，自己先看看背景知识才行～平时做实验只会瞎做，什么原理的都不懂
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13楼2011-03-07 13:46:19
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-03-07 11:56:19:
建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~
如果PCR产物插入了MCS位点，则LAZ基因被截断，不能表达，则克隆菌呈白色。
如果没插入MCS位点，而是自连的话，LAZ基因能表达，表达后产物与X-gal产生反应，变成蓝色蓝 ...

线性的质粒在大肠杆菌中不能表达吗
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14楼2011-03-07 22:28:39
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-03-07 11:56:19:
建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~
如果PCR产物插入了MCS位点，则LAZ基因被截断，不能表达，则克隆菌呈白色。
如果没插入MCS位点，而是自连的话，LAZ基因能表达，表达后产物与X-gal产生反应，变成蓝色蓝 ...

顶---
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16楼2011-03-08 12:16:57
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
没有加入外源DNA片段当然应该显蓝色，甚至有些小片段DNA连接后转化也会出现蓝色，因为LacZ基因有可能没有全部被打断，仍然可以转录表达。
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17楼2011-03-08 13:02:14
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小7~~~

金虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
帮顶吧 帖子都沉掉了
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18楼2011-04-28 10:44:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
没有连接上应该就会是蓝斑吧？
基因连接上之后就会将LacZ破坏掉，从而是单克隆显白色的。。。。
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19楼2011-04-28 10:47:39
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kwkw

木虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
promega的Tvector载体自连一直比较严重。
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20楼2011-04-28 17:30:58
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King.006

金虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
帮顶吧 都沉底了
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21楼2011-05-02 22:21:16
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King.001

银虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
帮顶吧
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22楼2011-05-03 15:34:57
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
295024楼: Originally posted by sxxuan at 2011-03-07 10:12:02
最近正在用这个载体，同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主，求解～

换用个载体哈，宝生物的19T之前用的还蛮好使
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24楼2012-11-28 15:29:34
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简单回复
skkyy888889楼
2011-03-07 12:32   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
zoujin12910楼
2011-03-07 12:38   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
198612楼
2011-03-07 12:48   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
wg42315楼
2011-03-08 12:14   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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