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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T载体连接目的片段后做蓝白斑全都是假阳性
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漫迹

金虫 (小有名气)

[求助] T载体连接目的片段后做蓝白斑全都是假阳性

我最近在做T载体，实验中发现连接目的片段转化DH5a后，在蓝白斑的板上出现的都是白斑，鉴定后全部是假阳性
    实验已确定的是：
    1 T载体构建的过程没有问题，因为刚构建好的时候连接目的片段试用后效率还是挺高的；
    2 X-gal 应该没有问题，最近也有其他人用同一批IPTG X-gal，平板上也有蓝斑；
   3 连接的目的片段是PCR产物，所用Taq酶不是高保真的，就是说末端是加了A的；
   4 T载体和PCR产物都是切胶回收的

    本人自己分析的原因有可能是T载体的T末端碱基丢失了，但是该末端是酶切后产生的，感觉不应该那么容易掉
    还请高人帮忙分析一下原因，还有如果是我分析的原因该怎么避免
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1楼 2011-10-10 11:13:38
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

T载体需要切胶回收吗？不是直接用的吗？
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在等待中涅槃重生
2楼2011-10-10 11:38:01
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuxia82012 at 2011-10-10 11:38:01:
T载体需要切胶回收吗？不是直接用的吗？

我是研发T载体的 酶切后制备商用T载体
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3楼2011-10-10 14:12:57
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 漫迹 at 2011-10-10 14:12:57:
我是研发T载体的 酶切后制备商用T载体

这个不是太懂，意思你研究的目的就是制备T载体？不是为了克隆基因？
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在等待中涅槃重生
4楼2011-10-10 14:14:56
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuxia82012 at 2011-10-10 14:14:56:
这个不是太懂，意思你研究的目的就是制备T载体？不是为了克隆基因？

是的呢
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5楼2011-10-10 17:50:25
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我以前的毕业论文是做T载体制备。除了你分析我原因外，我觉得还有可能是某段基因序列发生突变。
     仅仅是个人观点
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6楼2011-10-11 10:24:35
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

分析：应该是你酶切所制备的T载体有问题刚开始你所制备T载体经酶切顺利形成T端，所以验证成功，效率也不错，但你以后的实验中，你同样采用了酶切来制备T载体，很有可能切后仅形成了一个T，而另一个没有切开形成T端，那你的结果只能是100%假阳性，，所以还是从酶切着手去验证一下吧
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7楼2011-10-11 11:22:38
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