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有关T载体以及蓝白筛选的3个问题
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将目的片段与T载体连接，之后转化，蓝白筛选 1.长出白斑，说明T载体之间连上了片段，此片段就应该是目的片段了，因为之前的电泳确定目的片段为单一条带，割胶回收后再跑电泳也是单一条带，但是后续的测序要么是片段大小不对，要么是空载。 2平板在4度放了一段时间拿出来确定菌落是白色，第二天再看还是白色，不可能是传说中的没有变蓝，难道空载的也会是蓝色？那蓝白筛选还有什么作用 3菌落pcr有正确条带，对相应的菌提取质粒，送去测序后结果总是不对，这是为何？感受态转化之后的涂布量应该怎么控制，会不会是我涂布了过多的菌泥导致游离的质粒都附着在了菌落上或者周围，导致的结果就是挑取十个白斑，十个白斑pcr都正确，结果测序都不对，这种可能性应该不大吧 |
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1. 白斑说明有插入，是不是目的片段就不一定了，所以蓝白斑只是初筛，需要进一步鉴定。 2. 空载体是蓝斑。 3. 菌落PCR会有假阳性的可能。对阳性克隆提质粒做酶切鉴定后再送测序。转化涂布的量一般考经验控制，新手可以多涂几个不同量的板子。菌落PCR一般用的是载体上的引物，如果用片段特异性引物也是一个用片段特异引物，一个用载体上的引物。所以你说的什么游离DNA影响PCR扩增的假设基本不成立。而且你也对阳性克隆提取了质粒，应该先做酶切鉴定，酶切图谱正确后再测序。 |
4楼2013-10-13 01:40:09
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