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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选白色菌落PCR无条带
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 蓝白斑筛选白色菌落PCR无条带

如题，最近在做蓝白斑筛选，目的条带是原来PCR产物切胶回收的，用的是宝生物的PMD18-T载体，感受态是自己实验室制的，在平板上过夜培养后有蓝斑也有白斑，挑取白斑菌落，在PCR反应体系中蘸一蘸进行菌落PCR，但是电泳结果没有条带，请问各位虫友是载体自连了吗？多板均有蓝斑白斑，都是载体自连吗？
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1楼 2013-07-26 09:06:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
windycui(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-26 12:54:56
你确定菌落PCR的体系没有问题吗？做菌落PCR时是否做了正负对照？
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2楼2013-07-26 09:51:10
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史前五百年

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
windycui(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-26 12:56:26
做个阴性对照平板就知道了。
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3楼2013-07-26 10:02:06
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)
没对照没真相
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4楼2013-07-26 11:45:29
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 09:51:10
你确定菌落PCR的体系没有问题吗？做菌落PCR时是否做了正负对照？

没有做对照，请问正负对照是什么意思呢？
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5楼2013-07-26 12:16:43
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 史前五百年 at 2013-07-26 10:02:06
做个阴性对照平板就知道了。

阴性对照平板是不加什么？我做的对照是不加载体直接加感受态平板，什么都没有
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6楼2013-07-26 12:18:01
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biomed_fanyi at 2013-07-26 11:45:29
没对照没真相

请问怎么对照呢？
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7楼2013-07-26 12:18:14
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史前五百年

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
windycui(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-26 17:44:23
windycui: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，准备下周重新做做试试 2013-07-27 10:28:13
引用回帖:
6楼: Originally posted by windycui at 2013-07-26 12:18:01
阴性对照平板是不加什么？我做的对照是不加载体直接加感受态平板，什么都没有...

第一：你做PCR实验室做阳性对照么？没有的话最有可能的是退火温度的问题。
第二：阴性对照打错了，是阳性对照，TAKARA 上面的pMD18-T Vector 的说明书里面有介绍。
第三：可以挑些蓝色的点进行菌液PCR.
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8楼2013-07-26 13:14:23
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denghengning

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-26 17:44:33
一、做一个对照
二、看是否是载体空载了，或许因为连接效率太低，如果有必要，可以多挑几个菌来做一做。
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9楼2013-07-26 14:03:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
windycui(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-26 17:44:43
引用回帖:
5楼: Originally posted by windycui at 2013-07-26 12:16:43
没有做对照，请问正负对照是什么意思呢？...

PCR筛选做对照是常识，因为可能有假阳性。负对照一般就是master mix无模板对照，正对照就是含有载体中有插入已知片段的菌落，就是确定PCR体系没有问题。
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10楼2013-07-26 14:58:07
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