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s24512453

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选实验中对照组平板长出很多菌落 但是实验组平板上一个菌落没有

1.PCR扩增出1000bp的目的基因，电泳后胶回收，目的基因两端的酶切位点分别是ECOR1和BAMH1（引物是自己设计）
2.对质粒pUC18（2686bp，具有氨苄抗性，可用于蓝白斑筛选）进行双酶切，两个酶分别是宝生物的ECOR1和BAMH1（这两个酶的酶切buffer和酶切温度都不相同，通用buffer表中建议使用bufferK，在bufferK中ECOR1的酶切效率是120，BAMH1是100，那个120让我很诧异）。按照说明书添加相应的量，先30℃ECOR1酶切5min，之后再37℃BAMH1酶切5min（3h以及过夜都试过）。分别设立单酶切对照组：ECOR1  30度单酶切、BAMH1  37度单酶切（对照试验buffer都是K）。电泳检测表明三者都处于同一位置的条带上，（单酶切都切开了，双酶切应该没有问题）而未经过酶切的质粒则单独在另一位置，相差500bp左右。之后对双酶切质粒进行胶回收。
3对目的片段进行双酶切，条件同上，电泳之后胶回收（酶切之前目的片段已经是经过胶回收后的，酶切后再进行回收，条带很暗，但是还是有，浓度无法精确估计）。
4目的片段和质粒的链接：采用宝生物的链接试剂盒，载体和目的片段的比例试过1:10和1:3，加入solution1后16度半小时（16度过夜也试过）。
5将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞（宝生物）中，转化过程都按照说明书进行，对照组是空质粒pUC18和无菌水。加入无菌水的平板不长菌(大肠杆菌本身没有氨苄抗性)；空质粒pUC18的平板都是蓝色菌落（说明pUC18进入了大肠，表达了氨苄抗性），重组质粒的平板上什么菌都没有（长时间培养也没有，4度冰箱长时间放置也没有）
写的过于繁杂，但求高手指点！！！
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1楼 2013-05-23 18:34:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
s24512453: 金币+5, ★有帮助 2013-05-24 10:44:57
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-05-24 14:05:13
目的片段设计酶切位点的5‘端是否加了保护碱基？虽然EcoRI和BamHI都是很好用的酶，切目的片段时由于位点位于片段的尾端，酶切时间也应该适当延长来确保酶切效率。此外，目的片段做了两次胶回收，损失会比较大。如果PCR只有一条带，PCR后和酶切后都可以不用胶回收，直接用PCR产物回收kit就可以了。
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2楼2013-05-24 05:36:08
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s24512453

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-24 05:36:08
目的片段设计酶切位点的5‘端是否加了保护碱基？虽然EcoRI和BamHI都是很好用的酶，切目的片段时由于位点位于片段的尾端，酶切时间也应该适当延长来确保酶切效率。此外，目的片段做了两次胶回收，损失会比较大。如果 ...

必须严格按照那个保护碱基表来加吗？BAMH1的保护碱基是              CGC   GGATCC  GCG，我加前面的CGC还是说后面的GCG也要加？
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3楼2013-05-24 10:44:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by s24512453 at 2013-05-24 10:44:05
必须严格按照那个保护碱基表来加吗？BAMH1的保护碱基是              CGC   GGATCC  GCG，我加前面的CGC还是说后面的GCG也要加？...

保护碱基重要的数目，不是具体什么碱基。不同的酶所需要的数目不同。加保护碱基是在引物的5'端，这样酶切位点就不会直接在末端了。而且引物的5'端与模板是否匹配对PCR来说不很重要。
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4楼2013-05-24 11:03:15
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