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蓝白斑筛选实验中对照组平板长出很多菌落 但是实验组平板上一个菌落没有
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1.PCR扩增出1000bp的目的基因，电泳后胶回收，目的基因两端的酶切位点分别是ECOR1和BAMH1（引物是自己设计） 2.对质粒pUC18（2686bp，具有氨苄抗性，可用于蓝白斑筛选）进行双酶切，两个酶分别是宝生物的ECOR1和BAMH1（这两个酶的酶切buffer和酶切温度都不相同，通用buffer表中建议使用bufferK，在bufferK中ECOR1的酶切效率是120，BAMH1是100，那个120让我很诧异）。按照说明书添加相应的量，先30℃ECOR1酶切5min，之后再37℃BAMH1酶切5min（3h以及过夜都试过）。分别设立单酶切对照组：ECOR1 30度单酶切、BAMH1 37度单酶切（对照试验buffer都是K）。电泳检测表明三者都处于同一位置的条带上，（单酶切都切开了，双酶切应该没有问题）而未经过酶切的质粒则单独在另一位置，相差500bp左右。之后对双酶切质粒进行胶回收。 3对目的片段进行双酶切，条件同上，电泳之后胶回收（酶切之前目的片段已经是经过胶回收后的，酶切后再进行回收，条带很暗，但是还是有，浓度无法精确估计）。 4目的片段和质粒的链接：采用宝生物的链接试剂盒，载体和目的片段的比例试过1:10和1:3，加入solution1后16度半小时（16度过夜也试过）。 5将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞（宝生物）中，转化过程都按照说明书进行，对照组是空质粒pUC18和无菌水。加入无菌水的平板不长菌(大肠杆菌本身没有氨苄抗性)；空质粒pUC18的平板都是蓝色菌落（说明pUC18进入了大肠，表达了氨苄抗性），重组质粒的平板上什么菌都没有（长时间培养也没有，4度冰箱长时间放置也没有） 写的过于繁杂，但求高手指点！！！ |
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