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姑娘

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[资源] 基因工程课程小结

给大家借鉴一下，也欢迎大家提点意见！！！

《基因工程》小结
基因工程就是按照人们的愿望进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。简单地说，基因工程的基本技术路线就是：从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分子切开，用DNA连接酶将两者连接起来，转入到受体细胞，筛选出重组子，从而进行扩增培养、诱导表达。当然，外源基因的稳定高效表达是基因工程的主要战略思想。总体概括地说，基因工程的基本技术路线是：分、切、接、转、筛、增。
分（目的基因的分离）
目的基因：需要研究的基因。
目的基因的制备：
对已知序列的DNA分子或已知定位的目的基因，可以直接采用限制性核酸内切酶来分离目的基因。假若基因片段的理化性质如浮力密度和解链温度的差异，可以用物理方法进行目的基因的分离。如果某一真核细胞的蛋白质已经进行分离纯化，并且足以产生特定的抗体，我们可以用双抗体免疫法分离编码这种蛋白质的基因。同时可以利用酶促反转录法直接从特定的mRNA中分离目的基因。
由于要分离的基因往往是未知的，无法对此进行特异性的扩增，只能对所有的基因进行扩增，就是构建该生物材料的基因组文库。它克隆的是任何基因，是真实基因，含有全部遗传信息。但是真核生物的基因组文库非常的庞大，存在大量的重复序列和非编码序列，严重干扰了基因的分离，我们采用了构建cDNA文库来缩小目的基因的搜索范围，其克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，不含内含子，不含有全部遗传信息，是不完全编码的基因序列。从而降低了分离目的基因的难度。两者的建库步骤类似：基因组DNA（或mRNA→cDNA）的片段化，再与载体进行连接，转化到受体细胞后进行文库扩增与保存，再进行目的基因的筛选。
PCR技术广泛应用于目的基因的扩增和分离。其原理是利用温度将底物双链DNA变性为单链，并在退火温度下利用引物浓度高、链短的优势先与模板链结合，最后在适宜的延伸温度下进行延伸，这样循环n次后，就可以得到2n条DNA。PCR反应受到多种因素的影响，例如耐高温聚合酶的类型，模板的纯度与浓度，dNTP 、Mg2+浓度的影响，但是最为显著的就引物的影响。在进行PCR过程中，引物的设计很关键，都具备一定的原则。其3’端决定引物的特异性，与模板一定要配对，5’端是决定PCR产物的长度，与模板是否配对并无影响。只要3’端由足够长度来启动延伸便可。所以，我们可以对引物的5’端进行修饰，如插入酶切位点。
在利用PCR进行目的基因扩增时，由于模板本身的差异性，PCR引出了相关的技术。（1）RT-PCR：从已知序列的mRNA中反转录形成cDNA时，可以利用RT-PCR扩增特定的cDNA片段，并且不需要对mRNA进行纯化。（2）假若已知DNA序列：可以利用套式PCR、多重PCR、不对称PCR进行扩增。其中套式PCR利用的是两对引物扩增同一样品的方法，由于内外侧引物的作用，会使套式PCR越来越短。而多重PCR是利用多对引物同时扩增模板上的多个靶序列，假若我们加入的是两对引物，其扩增的序列可能是不一样的。（3）已知cDNA的一端序列获得全长cDNA的PCR扩增：有RACE和锚定PCR。（4）如果已知了侧翼序列，可用反向PCR和锅�?PCR进行扩增。此外，对于未知序列的基因，我们同样可用PCR扩增。
有时候我们所用的基因序列已经已知了，并且序列长度较短，我们可以利用化学合成。
目的基因的分离：可以根据基因的功能克隆、序列克隆等方法进行筛选分离
目的基因。
综合以上所述，获得目的基因方法的选择是极其重要的。可根据获得目的基因的研究目的选择合适的方法，根据目的基因的本身特点选择方法，以及根据实验室设备条件选择不同的方法。
切
限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中特殊核酸序列，并使每条链
的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，存在着限制与修复系统。细菌正是利用R/M系统来区分自身DNA和外源DNA的。
目的基因的片段化：
要进行DNA体外重组，必须获得需要重组和能够重组的DNA片段。用限制性核酸内切酶切割天然的DNA 分子，可获得含有完整基因、复制起始位点、转录启动子或转录区等均有特定功能的DNA片段。限制性核酸内切酶切割DNA的位点可以产生三种DNA片段末端：黏性末端、平末端和非对称突出端。切割的方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种，有时得充分同尾酶和同裂酶的功能。
3、载体酶切及构建
分离出了所需要的目的基因后，我们需要选择合适载体对DNA进行克隆，制备足够量的达到一定纯度的载体DNA。外源基因往往不能自行复制，很难进入细胞，需要载体将其引入宿主细胞才能进行复制或表达。这是因为载体能够运送外源基因转入到受体细胞内，为其提供复制能力或整合能力，并能为外源基因的扩增和表达提供条件。
载体的酶切与外源基因的酶切一样。
由于天然的载体存在着局限性，因此我们要构建载体，按功能可将载体分为克隆载体和表达载体两种基本类型。克隆载体主要包括质粒载体、噬菌体载体、粘性载体、人工染色体载体等。
质粒载体：质粒克隆载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体。质
粒是存在宿主细胞内，独立于染色体外的可自主复制闭合环状的DNA分子。它不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抗体外界不良环境的能力。质粒载体必需具备的具备有复制起点、筛选标记、具有若干限制性内切酶的单一位点，具有较小的分子量和较高的拷贝数。
在改造和构建质粒载体的时候，需要删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量来提高外源基因的装载量；灭活某些编码基因或产生负控效应的基因来提高拷贝数；加入易于识别的筛选标记基因来检测含有重组质粒的受体细胞；在选择性标记基因内引入具有多克隆位点的接头，同时删除重复的酶切位点；有时也会加装特殊的基因表达调控元件。
噬菌体载体：主要是λ噬菌体载体，它是感染大肠杆菌的病毒，由λDNA和
外壳蛋白组成。野生型λDNA必须经过改造才能成为理想的载体，主要有以下几个方面：①缩短长度，提高装载能力，切除多余部位；②删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性；③灭活某些与裂解周期有关基因，使λDNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌以避免可能出现的生物污染现象的发生；④引入合适的标记基因，便于重组噬菌体的检测；⑤建立重组λDNA分子的体外包装体系。
Cosmid载体：是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊
类型的质粒载体，其必须具备复制起点、抗性标记和cos位点。
对于以上的载体，要懂得比较其优缺点及其各自的特点。
载体载体大小装载能力优缺点或特性

质粒载体
多数10kb
<20 kb 具有自主复制、不相容性、可扩增性、可转移性

λ噬菌体载体
约25 kb 能高效转染大肠杆菌，装载能力大于质粒载体；筛选方便；λDNA提取方便。

Cosmid载体

5～7 kb

约45 kb 具有λ噬菌体的特性，不形成溶菌周期，含有质粒的特性，并具有高容量的克隆能力。但是载体或外源基因会自我连接或者多个本来不在一起的外源基因连接起来。

接（外源基因和载体的连接）
DNA连接酶：能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基末
端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。其连接的是切口，而不是裂口，也不能连接单链DNA或环化单链DNA。DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶，后者更广泛地应用：能够修复双链DNA的单链缺口；连接RNA-DNA杂交链上的DNA链的缺口或者RNA链的缺口；还能连接完全断开的两个平头双链DNA分子，因此T4 DNA连接酶更常用。
DNA片段的连接
具有互补黏性末端片段的连接：直接用连接酶进行连接。注意的是如果两
DNA片段末端是用同种酶进行酶切时，连接后的酶切识别序列没有发生变化，若用的是同尾酶进行酶切，连接后的酶切识别序列发生了变化。
具平末端DNA片段的连接：只能用T4 DNA连接酶进行连接，或者对其进
行修饰后再进行连接。
同聚物加尾法：利用末端转移酶具有催化dNTP加到单链或双链DNA3’羟基
末端的能力在载体分子和外源基因的DNA 3’羟基末端加上互补同聚物尾巴，再进行连接。
衔接物连接法：衔接物是指人工合成的一段由8～12个核苷酸，具有一个或
多个限制性核酸内切酶识别位点的寡核苷酸片段，其5’末端先用磷酸酯酶进行磷酸化，将衔接物和克隆载体分子连接产生黏性末端，再与外源基因片段进行连接。
接头分子连接法：可以使外源基因片段成为具有黏性末端的分子而易于同载体连接重组。
转（将重组DNA分子导入到受体细胞中）
受体细胞：能够摄取外源基因DNA并使其稳定维持的细胞。在选择受体细胞
时应该便于重组DNA分子的导入和筛选，选择某些限制性内切酶缺陷型、致病缺陷型、营养缺陷型、感染寄生缺陷型、内源蛋白水解酶基因缺失的受体细胞，并且细胞稳定性要好、安全性要高。由于原核受体细胞无蛋白质折叠复性系统、无蛋白质加工系统并易形成不正确的异源蛋白，所以在原核和真核受体细胞的选择时应注意。
实验室常用的受体细胞有：DH5α、JM101、毕赤酵母、啤酒酵母、中国仓鼠卵巢细胞等。
重组体转化原核生物细胞
转化法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细
胞内稳定维持和表达的过程。将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
Ca2+诱导大肠杆菌转化法：将处于对数生长期的细菌置于0゜C的CaCl2低渗
溶液中，细胞膨胀成球状而处于感受态，同时转化连接产物混合物中的DNA，Ca2+与DNA结合形成抗Dnase的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42゜C短时间热冲击处理，细胞吸收DNA复合物，在培养基中生长数小时后，球形细胞复原并增殖。实验时，注意实验组和对照组的长菌情况。
实验组：感受态细胞+质粒DNA（长菌）
DNA对照组：无菌水+质粒DNA（长菌说明DNA被污染）
感受态细胞对照：感受态细胞+NTE缓冲液（长菌说明感受态细胞被污染）
感受态细胞有效对照：感受态细胞+已知容易转化这种感受态细胞的DNA（长菌）
电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形
成可逆的瞬间通道，从而促进外源基因的有效吸收。
转导：指通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受
体细胞内的过程。转导一般用于描述通过病毒而发生的基因转移；其次，转移的必须是宿主的 DNA，病毒感染的时候，不少病毒 DNA 都可能整合到受体基因组，如果没有病毒以外的宿主 DNA，这个过程就不能叫做转导。自然情况下，一些病毒与宿主 DNA 发生重组，形成新的病毒基因组，包装以后感染其他细胞，就产生转导。实验研究中，常用基因重组的办法把目的 DNA 插入病毒基因组，实现目的基因的转导。最后，这个 DNA 必须整合到新宿主细胞基因组才算实现转导
转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。采用与质粒
DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖。
3、无载体介导的转化方法：磷酸钙转染技术、电穿孔、基因枪、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法等。
筛（转化子、重组子的筛选）
懂得区分转化子和非转化子、重组子和非重组子、目的重组子和非目的重组子的概念。
1、遗传遗传表型直接筛选法
1.1根据载体选择标记初步筛选转化子
（1）抗药性筛选：①几种常用的抗药性选择标记产物类型，如Ap、Cm、Kn、Tc等；两种遗传表型的表示方法，如：Apr、Tcs。②观察和确定转化子菌落的培养时间不宜过长，以12~16小时为宜，因为转化子菌落会降解选择药物，导致菌落周围选择药物浓度降低，长出非抗菌性的菌落，此外，在培养过程中这些选择药物会自然降解，导致药物浓度降低，长出假转化子的菌落。③实验组和对照组该不该长菌及其原因：
实验组：感受态细胞+质粒DNA（长菌）
DNA对照组：无菌水+质粒DNA（长菌说明DNA被污染）
感受态细胞对照：感受态细胞+NTE缓冲液（长菌说明感受态细胞被污染）
感受态细胞有效对照：感受态细胞+已知容易转化这种感受态细胞的DNA（长菌）
（2）插入失活筛选法：将Apr的转化子影印到含四环素的平板上。由于外源DNA片段插入到载体DNA的酶切位点上，导致Tcr失活。重组子的遗传表型为AprTcs
（3）插入表达筛选法：例如pTR262质粒载体，其Tcr基因的上游有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白的编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr的表达。外源基因片段插入到CI基因的酶切位点使得CI基因失活，从而重组子表现为Tcr的表型。
（4）显色互补筛选法：蓝白斑筛选；假若是麦康锴培养基，就不是蓝白斑，但筛选原理是一样的。
1.2营养缺陷型检测法：转化进来的外源基因产物弥补受体菌的突变型缺陷，使被转化的受体菌表现出外源基因的表型，利用选择性培养基进行筛选。
1.3形成噬菌斑筛选法：将外源基因克隆到β-LacZ区段的插入型噬菌体上后，重组噬菌斑为无色透明，而非重组子噬菌斑为蓝色。
2、依赖于重组子结构特征分析的筛选法
2.1快速裂解菌落鉴定分子大小：利用琼脂糖凝胶电泳时迁移速率的快慢鉴定重组子和非重组子。重组子的迁移速率较慢。
2.2限制性核酸内切酶酶解分析法：利用重组质粒电泳条带多一条鉴定重组子和非重组子；并根据酶切图谱分析其插入方向。
2.3利用PCR方法筛选确定重组子：提取质粒DNA进行PCR，再对其产物进行电泳确定是否是重组子菌落。
3、核酸分子杂交检测法：具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的稳定及离子强度下，可以按照碱基互补配对的原则高度特异性地复性形成双链。杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段，即探针。
（1）Southern印记杂交：用核酸探针来检测DNA样品。DNA酶切后进行电泳，然后进行碱变性和中性处理后转膜，烘干，加入探针杂交，再进行洗膜和检测。
Northern印记杂交：用核酸探针检测RNA样品，主要是检测插入片段是否被转录。其原理就是相对分子质量不同的RNA在凝胶电泳上的转移速率不同，通过凝胶电泳来分离不同大小的RNA，再将分开的RNA转移到硝酸纤维膜上，利用特定的标记探针杂交来检测与探针互补的RNA..但是电泳前要进行热变性，或加入变性剂。
斑点印记杂交：检测总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特定的DNA或RNA。
菌落原位杂交：是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，并依次进行溶菌、变性，烘干后与核酸探针杂交，再进行洗膜和检测。
Southern印记       Northern印记       斑点印记       菌落原位杂交
杂交                杂交             杂交          将菌落或噬菌
提取DNA       提取DNA       提取DNA（RNA）    斑复印到膜上
↓                ↓             ↓                ↓
↓                   变性核酸       裂解细菌或噬体
琼脂糖凝胶电泳                   ↓                ↓
      ↓                   核酸点到膜上       变性DNA
将核酸转移到膜上
↓
                                 ↓
                              将核酸固定到膜上
                                 ↓
                        预杂交（清楚非特异性吸附位点）
                                 ↓
                                    加入标志的探针杂交
                                 ↓
                        漂洗膜（吸取非特异性结构的探针）
                                 ↓
                           放射自显影或显色反应示踪

（2）探针：是指具有一定序列的核苷酸片段，能与互补的核酸序列进行复性杂交，并能通过适当的标记进行检测。可以用缺口平移标记法、随机引物标记法、末端标记法进行探针的标记。作为理想的探针其标记物不会影响探针的主要理化性质，检测灵敏性高、特异性强，操作起来得方便简单，经济实用，并且安全性要高，无环境污染。
4、免疫化学杂交：利用抗体作为探针来检测受体菌并且能表达出相应的蛋白质的外源基因，即是蛋白质-蛋白质的杂交。
4.1抗体检测法：一抗、二抗和产物的结合进行检测
4.2酶联免疫吸附测定（ELISA）：。
4.3免疫沉淀检测法：在生长有转化子菌落的培养基中加入与目的基因产物相对应的抗体，如果菌落会产生与抗体相对应的抗原蛋白，则其周围就会出现一种叫沉淀素的抗体-抗原沉淀物形成的白色菌落。
4.4免疫印记法：关键是蛋白质电泳。
5、基因表达产物分析：①对于转录产物，用Northern印记杂交技术进行检测分析。②免疫化学检测基因产物：免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印记杂交、固相放射免疫法。
6、DNA序列分析：
DNA的双脱氧链终止测序法：将待测的DNA单链作为DNA复制的模板，在
DNA聚合酶的催化下，有四种dNTP和ddNTP参与下，由于ddNTP与脱氧核苷酸链的末端3’羟基形成磷酸二酯键，3’-OH被脱氧为3’-H不参与链的延伸，因此合成各种长度的DNA片段，再进行凝胶电泳和放射自显影，从图谱中读出待测DNA的互补碱基序列，而非模板本身。
化学降解测序法：将待测的DNA分子进行末端放射性标记，然后置于4组
独立的化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中生成各种长度的、一端由放射性标记的寡聚核苷酸，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列。从5’端开始，DNA序列的读取时逆电泳方向进行的。
此外，还可以进行PCR测序、DNA自动化测序、杂交测序等。
增（利用PCR进行扩增）
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。

我们知道，外源基因的稳定高效表达是基因工程的主要战略思想。所以应该实现外源基因的正确有效表达。
对于外源基因在原核生物表达其表达的调控主要是转录起始的调控，其调控序列：启动子、终止子、衰减子、SD序列等。可通过表达载体将外源基因转入到宿主菌，并指导宿主菌酶系统合成外源蛋白；必须使用cDNA或全化学合成基因；利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；外源基因与表达载体连接后必须形成正确的开放阅读框；利用宿主菌的调控系统调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。常见的原核表达载体：大肠杆菌表达系统，外源基因在大肠杆菌的表达部位：细胞质、细胞周质和细胞外培养基。同时我们可以通过诱导表达和载体的诱导复制来减轻宿主细胞的代谢负荷。并经过克隆原核序列表达融合蛋白，或使用突变菌株或表达分泌蛋白来提高表达蛋白的稳定性时防止其降解。
对于外源基因在真核细胞中的表达，常见的酵母菌的载体系统有：YIp、YRp、Yep。酵母菌的转化系统有：利用酵母的原生质球进行转化和利用Li+盐进行转化。此外酵母菌的表达系统有四种，重点是巴斯德毕赤酵母系统利用甲醇进行诱导。
随着基因工程的不断成熟得以很多方面的应用，运用基因工程技术不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。同时，基因工程在制药、酶制剂的生产中都取得了一定的进展。

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