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sl35537417

木虫 (正式写手)

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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-26 18:19:02

微型菌落是氨苄降解后生长的杂菌可以将培养时间控制在12h-16h之间
或者更换抗生素为羧苄青霉素，你的载体是什么？双酶切？估计是连接效率不高？

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2楼2012-08-26 11:03:56

Marado

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Dreamer

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小丹木木: 金币+3, 鼓励积极热心应助 2012-08-27 13:48:30

1：涂板后培养12个小时，平板不长菌或者只长五六个菌斑
平板不长菌，感受态细胞是否失活，可以做个对照，看看是否是感受态细胞的问题，如果不是，就要考虑转化过程是够出现操作失误，例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间12~16h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:3~1:10.
只长五六个菌PCR检测空白或者目的条带不对，这个你可以考虑做蓝白斑，初步可以筛掉一大批的假阳性，目的条带不对估计是载体自连了.
另外卫星菌落的话不需要太顾虑，培养时间久了，氨苄降解了很多假阳性自然就长出来了，氨苄只是抑制不是杀死，一般12h内的菌落都不会出现卫星菌落.
祝楼主好运.

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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

7楼2012-08-27 10:22:13

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fjtony163

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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-27 13:48:02

那个小菌落跟你期望没啥关系，
你知道你那个目的片段的copy的量大概多少，如果太低可以用IPTG增加copy，然后吧培养时间缩短成有梯度的，再看看载体上有别的resistance没有。

3楼2012-08-26 17:39:43

linda90

禁虫 (初入文坛)

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4楼2012-08-26 20:43:18

aofeng860308

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引用回帖:

4楼: Originally posted by linda90 at 2012-08-26 20:43:18
载体是takara公司的18-T，没有酶切...

T载体是可以通过蓝白斑筛选的啊，如果目的基因纯的话直接挑取白斑测序就好了，不用做菌落PCR的。长卫星菌落最主要的一个原因就是培养基温度太高时就加入氨苄青霉素，导致氨苄被破坏，就很容易长卫星菌落了。

5楼2012-08-26 21:32:05

gl1986825

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还有就是你连接反应的时间是不是有点长，导致载体自连了？

6楼2012-08-27 01:13:54

gwd0312

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建议蓝白斑筛选，同时缩短培养时间，摇菌是建议挑一个蓝斑做对照！

持之以恒、永不放弃！

8楼2012-08-27 13:12:19

实心小白菜

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linda90: 金币+1, ★有帮助 2012-09-01 14:27:48

T载体用的酶和buffe是否都是配套的，一般商品化的T载体连接效率都很高滴，不过你这个目标片段太大，确实有问题，考虑调整比例，记住insert和载体3:1的比例是算上了长度的哦，调整用的insert量，检验用的感受态细胞，多养一会，多涂一点，什么都哄着它，慢慢就连出来了。

有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~

9楼2012-08-27 18:52:39

实心小白菜

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刚才忘说了，卫星菌落只是由于养的时间长了，如果连得好，不用长那么长时间久好了~

有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~

10楼2012-08-27 18:53:42