[交流] 质粒转化到大肠杆菌野生菌中验证遇到的非常非常怪的问题 已有1人参与

如题,我将4个质粒p3,p4,p5,p6转化到大肠杆菌野生菌中,该菌已报道有野生质粒,并对外源质粒有排斥性.质粒转化后挑出能在kan平板生长的菌落,此时原菌不能在抗生素平板生长,说明(1)抗生素未失活(2)原菌不具有kan抗性.接下来就是验证. (1)提质粒,如图1,p1,p2为原菌,p3-p6为重组菌.可是提出质粒图谱一样的,p3,p4 是7K多,p5,p6是8K多.但是没什么差别.将这6个质粒进行双酶切验证,第一次酶切完什么都没有了,第二次切出弥散的条带,6个都一样. (2)PCR验证 如图2,第一个M前面6个,是用重组质粒上的抗性引物PCR,中间的4个和后面的4个分别是用重组质粒上携带的目的基因引物PCR,可是原菌仍然有条带.只是稍稍弱一些. (3)将PCR产物进行酶切 也许是我这三对PCR引物特异性不好,所以可能有假阳性存在,但是原菌和重组菌的PCR片段应该不一样,而且第一个是抗性片段,原菌是没有抗性的,所以应该是不一样的,可是我用三个PCR片段中的单酶切位点进行酶切后,见图3,也悲剧了,还是一样一样的,而且酶切片段与理论上是相符的.哎,这到底是个什么菌啊,岂能如此强大.现在唯一确定的就是重组质粒具有抗性了.请问各位高手们,这种情况下我该怎么去验证和解释? 图1 图2 图3

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