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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取大肠杆菌质粒失败的原因
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y_ylili

铁虫 (初入文坛)

[求助] 提取大肠杆菌质粒失败的原因

用碱裂解法发提取大肠杆菌质粒DNA~加入异丙醇之后有大量的絮状物，离心后沉淀很少，乙醇洗涤，干燥，跑胶的居然没有亮带？！已经做了3次~十几管了~呜~纠结....求助....
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时间生物学
1楼 2011-04-24 16:45:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

y_ylili(金币+1): 莪是加了3液以后再加的氯仿 异戊醇的(～ o ～)~zZ 2011-04-26 18:02:15
引用回帖:
Originally posted by y_ylili at 2011-04-25 13:53:30:
只是做一个验证，所以粗糙了些....下边是实验步骤：
菌液离心弃上清>加1液（Tris-Cl  EDTA）>加2液（SDS  NaOH）混匀冰浴>加3液（中和液）>加酚/氯仿/异戊醇>取上清（不够细心，偶尔取到中层， ...

你的试剂配制有问题：你用的是碱裂解法提取质粒，溶液一和溶液二没有问题，但溶液三你叫它中和液，但成分竟然是酚氯仿异戊醇，没有酸怎么能叫中和液呢，正常的成分是冰醋酸和3mol/L的醋酸钾，溶液三中的钾离子置换了SDS中的钠离子生成了不溶性的PDS，大家都知道SDS专门喜欢结合蛋白质，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以由于置换产生的大量沉淀顺便连蛋白质也沉淀下来了，又因为基因组DNA实在太长了，在这个过程中很自然的被PDS给共沉淀了。你所谓的酚氯仿异戊醇是纯化DNA或RNA时用到的，先弄清楚每种试剂的作用做起来就不会这么盲目了，祝你好运！
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2011-04-25 15:43:17
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-04-25 09:51:35
y_ylili(金币+1): (～ o ～)~zZ 2011-04-26 18:00:52
“加入异丙醇之后有大量的絮状物”这个是蛋白质吧。抽提之后，你取上清取到中间相的蛋白质啦。
你把详细步骤发上来，大家才好帮你分析哦。
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2楼2011-04-24 17:17:57
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼上正解，吸到中间层了。
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3楼2011-04-24 17:34:02
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

用试剂盒吧，呵呵，算算成本其实差不多的还比较稳定
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在等待中涅槃重生
4楼2011-04-24 18:14:31
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-04-25 09:51:44
加入异丙醇是为了沉淀核酸。。。。
至于你说的絮状物，是你提取的时候杂蛋白太多、、、、
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-04-24 22:43:35
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0610616

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

抽提时取的上清液不纯吧！我提取质粒用的是无水乙醇醇沉的，效果也很好!
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Everythingisok!
6楼2011-04-24 23:44:26
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-04-25 09:51:57
你把具体步骤写一下
就说这点
没有人知道你问题出在哪里
我们也会异丙醇沉淀，可以啊，没问题
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7楼2011-04-25 00:40:23
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wzwhq

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-04-25 09:52:05
提质粒时可以用苯酚氯仿抽提两边，这样效果好，一般就不会出现大量蛋白沉淀。
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8楼2011-04-25 08:50:58
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y_ylili

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by y_ylili at 2011-04-24 16:45:28:
用碱裂解法发提取大肠杆菌质粒DNA~加入异丙醇之后有大量的絮状物，离心后沉淀很少，乙醇洗涤，干燥，跑胶的居然没有亮带？！已经做了3次~十几管了~呜~纠结....求助....

只是做一个验证，所以粗糙了些....下边是实验步骤：
菌液离心弃上清>加1液（Tris-Cl  EDTA）>加2液（SDS  NaOH）混匀冰浴>加3液（中和液）>加酚/氯仿/异戊醇>取上清（不够细心，偶尔取到中层，多数都没取到中层）>异丙醇离心弃上清>乙醇洗涤（有的沉淀在这步给弄丢了）>干燥加TE....
莪新手....操作问题很大~~~~(>_<~~~~
望指导....
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时间生物学
9楼2011-04-25 13:53:30
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