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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒转入大肠杆菌怎么都不长啊
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可可猫

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒转入大肠杆菌怎么都不长啊 已有11人参与

最近将老师从国外带回来的质粒转入大肠杆菌然后抽提，该质粒是Amp抗性的，热转后铺到平板上一个克隆都没有。

我用的是200微升的感受态里面加五微升质粒，质粒浓度是140ng/微升

所用的培养基的Amp浓度是100ng/ml

感觉应该是没转进去，不知道问题到底出在什么地方

请各位有经验的师兄师姐帮我看看哈
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1楼 2010-08-29 09:51:23
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linysm

银虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-08-29 12:49:14
质粒可能不行了，要不就是感受态效价太低，建议做效价高一点的感受态；要不就把目的条带切下来，自己重新克隆。
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2楼2010-08-29 10:40:45
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夜龙舞

金虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-08-29 12:49:34
化学转化效率比较低，不行得话你就试一下电转化。
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3楼2010-08-29 11:01:33
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周_yan

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-08-29 12:49:41
我认为有以下几个原因：
一、质粒时间久了，不行了。
二、感受态不行了，
三、Amp失效了，
四、转化时操作不规范。
建议弄点超感，重新配板，操作时注意一下。如果这些都没问题，仍不长，就重新弄质粒吧。
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4楼2010-08-29 11:08:07
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louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒浓度如何啊，如果浓度高的话，你的感受态会胀破。你试试2微升转入500微升的 感受态中
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5楼2010-08-30 08:47:41
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
顺便问下楼主测定质粒的浓度用得是什么方法？
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6楼2010-08-30 10:25:20
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273914823

木虫 (小有名气)

木虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是质粒浓度太大，我们才用2ul, 还有转化的时候温度的控制是很严格的
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努力做得最好
7楼2010-08-30 10:39:25
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可可猫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yangjunzju at 2010-08-30 10:25:20:
顺便问下楼主测定质粒的浓度用得是什么方法？

用的是微量分光光度计
可以直接测定
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8楼2010-08-30 11:50:24
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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silicare(金币+2):谢谢交流 2010-08-30 18:53:53
有的质粒只在某些特定的菌内才能存活，如有ccdB基因，则不能用普通大肠杆菌（DH5a,Top10）,必须用T'或DB3.1才行。问问你的老师，该质粒对菌株有何要求。
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9楼2010-08-30 11:58:07
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smallcat227

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-08-29 11:08:07:
我认为有以下几个原因：
一、质粒时间久了，不行了。
二、感受态不行了，
三、Amp失效了，
四、转化时操作不规范。
建议弄点超感，重新配板，操作时注意一下。如果这些都没问题，仍不长，就重新弄质粒吧。

Amp失效应该满平板全是菌才对……
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10楼2010-09-01 23:07:30
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