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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？已有8人参与

最近在做质粒构建的工作，当没有完成最终构建之前，质粒DNA转化大肠杆菌都很正常，而且很容易转化成功，但是将质粒构建成功后，转化大肠杆菌变得非常困难，而且DH5a转不进去;JM109，TOP10转入后，跑电泳比我的目的质粒小了，做双酶切检定，不是我要的质粒载体，这是怎么回事呢？
我做的是一个重组酶的载体，原始载体是pBV220，将构建好的质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中，在30°培养时，重组酶是否表达？原因是我在没诱导之前，质粒DNA已经发生了部分的重组。
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相信自己，一定能成功！
1楼2011-04-12 22:00:44
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+2): good 2011-04-13 08:46:36
引用回帖:
Originally posted by chui2004 at 2011-04-12 22:00:44:
最近在做质粒构建的工作，当没有完成最终构建之前，质粒DNA转化大肠杆菌都很正常，而且很容易转化成功，但是将质粒构建成功后，转化大肠杆菌变得非常困难，而且DH5a转不进去;JM109，TOP10转入后，跑电泳比我的目的 ...

lz转化时用的化转么？看样子感受态细胞是购买的吧？

照lz说的情况，最可能的原因是质粒构建时候出问题了，建议重新酶切连接。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2011-04-12 22:21:19
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
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西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-04-13 00:17:35
重组载体一般比空质粒难转。。。。不过如果带有筛选体系的话就简单多了。。。。比如蓝白斑；

还有楼主说了，重组载体很难转，你后期怎么表达的？你最好先确定你这个重组载体的正确性以及是否已经转化进入了大肠杆菌，然后再进行下游实验。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-04-12 22:26:23
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-12 22:26:23:
重组载体一般比空质粒难转。。。。不过如果带有筛选体系的话就简单多了。。。。比如蓝白斑；

还有楼主说了，重组载体很难转，你后期怎么表达的？你最好先确定你这个重组载体的正确性以及是否已经转化进入了大肠 ...

我将构建好的质粒载体转入从某个公司买的E.clio DH5a感受态，这个感受态是个突变株，我这个质粒能转化进去（提的质粒测序，序列正确），但是转正常的DH5a就转不进去。
当转BL21时，质粒能进去，在30°培养时，出来了比目的质粒小的质粒，我将提出来的质粒做双酶切，与我的目的质粒的双酶切电泳图是一致的，因此，我是否可以判断我的质粒（原始质粒是pBV220)在30°时，重组酶已经表达了。
我现在很郁闷啊！不知道该怎么往下做了。
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4楼2011-04-13 08:23:50
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
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西瓜(金币+4): 继续加油啊～ 2011-04-13 10:31:36
引用回帖:
Originally posted by chui2004 at 2011-04-13 08:23:50:
我将构建好的质粒载体转入从某个公司买的E.clio DH5a感受态，这个感受态是个突变株，我这个质粒能转化进去（提的质粒测序，序列正确），但是转正常的DH5a就转不进去。
当转BL21时，质粒能进去，在30°培养时， ...

1：你说你转正常的DH5a转不进去，转从公司买来的DH5a突变株就可以，这其实很正常，因为突变株有可能会导致你的质粒挂掉。。。
2：你转BL21时，虽说质粒比目的质粒小，很正常，因为质粒在细菌中的状态是不断变化的，唯一验证的方法就是酶切，既然你现在酶切验证没什么问题，说明你的重组载体是没有任何问题的，至于你说的重组酶是否已经表达有何证据？基因连接到载体上面就一定会表达吗？即便你这个载体也是表达的载体，不知道你要表达这个重组酶是否需要添加诱导剂呢？
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5楼2011-04-13 10:14:08
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-13 10:14:08:
1：你说你转正常的DH5a转不进去，转从公司买来的DH5a突变株就可以，这其实很正常，因为突变株有可能会导致你的质粒挂掉。。。
2：你转BL21时，虽说质粒比目的质粒小，很正常，因为质粒在细菌中的状态是不断变化 ...

1.导致质粒挂掉是什么意思？
2.我做的是温度诱导，不知道pBV220是严格控制基因表达的载体？还是不严格的？
3.你是哪里的？有什么联系方式吗？
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6楼2011-04-13 10:55:22
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
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Originally posted by chui2004 at 2011-04-13 10:55:22:
1.导致质粒挂掉是什么意思？
2.我做的是温度诱导，不知道pBV220是严格控制基因表达的载体？还是不严格的？
3.你是哪里的？有什么联系方式吗？

温度诱导，那你就要把握好温度了，其实你这个载体我没用过，不过你可以查阅一下关于这个载体表达的一些文献，网上应该很多的。
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7楼2011-04-13 11:38:29
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2): good 2011-04-13 13:26:38
我也碰到同样情况，转化进去BL21的质粒，提取出来后质粒大小就部队了，大了一下
酶切也不一样了啊
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8楼2011-04-13 11:41:40
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-13 11:41:40:
我也碰到同样情况，转化进去BL21的质粒，提取出来后质粒大小就部队了，大了一下
酶切也不一样了啊

现在你的问题解决了吗？
我还在焦头烂额中。。。。。
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9楼2011-04-15 08:50:20
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
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我不知道能不能解决你的问题。
1 本来重组质粒就是难转化。还有的转化进去了结果拷贝数低。建议你先在TOP10中扩增质粒，然后再化转或者电转质粒，会比较好。
2 质粒是否与marker对应关系，记得使用的marker是质粒的marker，比如TAKARA的supercoil是可以对应的。如果你使用线性的marker当然不同。
而且，质粒有线性结构，环状结构，超螺旋结构，所以会有大小的不同三条带。
3 如果酶切质粒后的基因大小不对应，建议切胶回收送去测序看看确定下。
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
10楼2011-04-15 09:43:14
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