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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？ 已有8人参与

最近在做质粒构建的工作，当没有完成最终构建之前，质粒DNA转化大肠杆菌都很正常，而且很容易转化成功，但是将质粒构建成功后，转化大肠杆菌变得非常困难，而且DH5a转不进去;JM109，TOP10转入后，跑电泳比我的目的质粒小了，做双酶切检定，不是我要的质粒载体，这是怎么回事呢？
我做的是一个重组酶的载体，原始载体是pBV220，将构建好的质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中，在30°培养时，重组酶是否表达？原因是我在没诱导之前，质粒DNA已经发生了部分的重组。
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相信自己，一定能成功！
1楼 2011-04-12 22:00:44
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我不知道能不能解决你的问题。
1 本来重组质粒就是难转化。还有的转化进去了结果拷贝数低。建议你先在TOP10中扩增质粒，然后再化转或者电转质粒，会比较好。
2 质粒是否与marker对应关系，记得使用的marker是质粒的marker，比如TAKARA的supercoil是可以对应的。如果你使用线性的marker当然不同。
而且，质粒有线性结构，环状结构，超螺旋结构，所以会有大小的不同三条带。
3 如果酶切质粒后的基因大小不对应，建议切胶回收送去测序看看确定下。
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
10楼2011-04-15 09:43:14
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): good 2011-04-13 08:46:36
引用回帖:
Originally posted by chui2004 at 2011-04-12 22:00:44:
最近在做质粒构建的工作，当没有完成最终构建之前，质粒DNA转化大肠杆菌都很正常，而且很容易转化成功，但是将质粒构建成功后，转化大肠杆菌变得非常困难，而且DH5a转不进去;JM109，TOP10转入后，跑电泳比我的目的 ...

lz转化时用的化转么？看样子感受态细胞是购买的吧？

照lz说的情况，最可能的原因是质粒构建时候出问题了，建议重新酶切连接。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2011-04-12 22:21:19
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-04-13 00:17:35
重组载体一般比空质粒难转。。。。不过如果带有筛选体系的话就简单多了。。。。比如蓝白斑；

还有楼主说了，重组载体很难转，你后期怎么表达的？你最好先确定你这个重组载体的正确性以及是否已经转化进入了大肠杆菌，然后再进行下游实验。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-04-12 22:26:23
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-12 22:26:23:
重组载体一般比空质粒难转。。。。不过如果带有筛选体系的话就简单多了。。。。比如蓝白斑；

还有楼主说了，重组载体很难转，你后期怎么表达的？你最好先确定你这个重组载体的正确性以及是否已经转化进入了大肠 ...

我将构建好的质粒载体转入从某个公司买的E.clio DH5a感受态，这个感受态是个突变株，我这个质粒能转化进去（提的质粒测序，序列正确），但是转正常的DH5a就转不进去。
当转BL21时，质粒能进去，在30°培养时，出来了比目的质粒小的质粒，我将提出来的质粒做双酶切，与我的目的质粒的双酶切电泳图是一致的，因此，我是否可以判断我的质粒（原始质粒是pBV220)在30°时，重组酶已经表达了。
我现在很郁闷啊！不知道该怎么往下做了。
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相信自己，一定能成功！
4楼2011-04-13 08:23:50
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