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y_ylili

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 提取大肠杆菌质粒失败的原因

用碱裂解法发提取大肠杆菌质粒DNA~加入异丙醇之后有大量的絮状物，离心后沉淀很少，乙醇洗涤，干燥，跑胶的居然没有亮带？！已经做了3次~十几管了~呜~纠结....求助....

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时间生物学

1楼 2011-04-24 16:45:28

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空谷幽风

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

y_ylili(金币+1): 莪是加了3液以后再加的氯仿异戊醇的(～ o ～)~zZ 2011-04-26 18:02:15

引用回帖:

Originally posted by y_ylili at 2011-04-25 13:53:30:
只是做一个验证，所以粗糙了些....下边是实验步骤：
菌液离心弃上清>加1液（Tris-Cl EDTA）>加2液（SDS NaOH）混匀冰浴>加3液（中和液）>加酚/氯仿/异戊醇>取上清（不够细心，偶尔取到中层， ...

你的试剂配制有问题：你用的是碱裂解法提取质粒，溶液一和溶液二没有问题，但溶液三你叫它中和液，但成分竟然是酚氯仿异戊醇，没有酸怎么能叫中和液呢，正常的成分是冰醋酸和3mol/L的醋酸钾，溶液三中的钾离子置换了SDS中的钠离子生成了不溶性的PDS，大家都知道SDS专门喜欢结合蛋白质，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以由于置换产生的大量沉淀顺便连蛋白质也沉淀下来了，又因为基因组DNA实在太长了，在这个过程中很自然的被PDS给共沉淀了。你所谓的酚氯仿异戊醇是纯化DNA或RNA时用到的，先弄清楚每种试剂的作用做起来就不会这么盲目了，祝你好运！