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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌感受态制备及转化中的问题
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军歌

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌感受态制备及转化中的问题 已有3人参与

请求各位帮帮忙，本人制作完DH5α感受态以后，做转化，过夜，第二天菌斑长的还可以，但是有大有小，做PCR鉴定，结果什么都没有，我一共做了20个样品，全都是这样，我怀疑是杂菌，但是，如果质粒没有转进去，杂菌在含有抗生素（amp）的平板上是不会长的呀。会不会是载体自连？
另外，是不是涂完板后，只要长出菌斑，感受态就应该没有问题，我现在也不知道到底是我连接的有问题，还是我的感受态有问题
多谢各位能给与帮助
谢谢
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1楼 2010-08-25 09:52:00
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silicare

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优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
呵呵，好多杂菌都是基因组自带抗性的

有可能是你的感受态里边有杂菌，或者你的操作有点问题

amp会出一个微星菌落的问题，所以应该挑大斑

另外，如果抗生素效价低的话也肯能，但抗生素失效往往都是成片的没有单克隆，出单克隆的概率很低

所以基本可以断定是污染了杂菌

关于感受态，有菌只能说明他们没有死，不能反应效率，这个需要转化一个环形质粒做阳性对照

同时你也应该用未转化的感受态去做一个阴性对照，这样判断是不是感受态污染，是不是操作问题，是不是抗生素问题

所以你的问题做两个对照就解决了
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2楼2010-08-25 10:22:15
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
哈哈,你可以设计两组对照,一组阳性对照,用标准的质粒进行转化;一组阴性对照,不加任何DNA.一般情况下,阳性对照菌落长得很多,阴性对照不长菌.如果阴性对照长了,说明感受态受污染,有杂菌存在.
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3楼2010-08-25 13:19:57
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军歌

新虫 (初入文坛)
太感谢你们了，我按你们的方法试试，
谢谢
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4楼2010-08-25 13:44:54
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