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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 感受态的制备及转化？
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niuniu2010

铜虫 (初入文坛)

[求助] 感受态的制备及转化？

这是我制备感受态及转化的流程，近期转化一直不成功，请大家给予指导。转化所用质粒是长期存于-40℃的，不知道影响大不？
（一）DH5a菌感受态的制备：
1、从LB平板上挑取DH5a单菌落,接种于3LB液体培养基中 37℃下振荡培养12h左右直至对数生长后期培养基中。
2、将菌悬液以1:100的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜，再将菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生长对数期），约2-3h
3、将菌液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
4、每只离心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌体重悬，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
5、每只离心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬后分装到无菌的1.5ml离心管中(每管100µl)；
6、置-40℃冰箱长期保存；
（二）DH5a大肠杆菌的热击转化：
⑴ 分别在1管100µl感受态细胞中加入质粒1-2µl和无菌水1-2µl（阴性对照），轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴30min；
⑵ 将离心管放至42℃的循环水浴中90s；
⑶ 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却至室温；
⑷ 每管加800µl LB液体培养基，37℃培养箱中45min；
⑸ 取l转化的感受态细胞，分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻璃棒将菌液涂满整个平板表面；
⑹ 将平板置于超净台中直至平板表面菌液被吸收；
⑺ 封好平皿，倒置于37℃培养，12-16h。

[ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ]
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1楼 2011-04-22 08:47:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-22 13:56:15
niuniu2010(金币+1): 2011-04-22 15:27:59
你的流程没什么问题，是标准的转化流程。
你需要注意的是，如果感受态细胞要长期保存的话，最好分装后液氮速冻，然后置于-80度，基本上可以使用一年。
你转化不出的原因可能出在质粒上，如果你的质粒浓度不高又在-40保存时间过长的话，建议在转化过程中可以稍微多加一点。
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3楼2011-04-22 13:12:01
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-22 20:51:40
呵呵，我们也是使用超级感受态，转化效率高多了。
那个方法没问题。就是可能还是不够低温吧。都不好说。呵呵
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
7楼2011-04-22 16:35:57
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 应助回帖哦 2011-04-22 13:56:02
没看出有什么问题呀。注意的就是冰箱长期长期保存后转化效率会明显降低。
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2楼2011-04-22 10:43:15
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-22 16:02:52
我实验室做感受态用到了PIPES，效率蛮高的。楼主查查这个，网上一搜很多。
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仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2011-04-22 13:43:12
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-04-22 13:43:12:
我实验室做感受态用到了PIPES，效率蛮高的。楼主查查这个，网上一搜很多。

说的应该是超级感受态吧~~分子克隆上就有~~楼主可以看看
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5楼2011-04-22 15:25:08
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yanying198

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励！把Buffer I和Buffer II的配方交出来就给你EPI ^_^ 2011-04-22 16:44:12
西瓜:编辑内容 2011-04-22 19:09
西瓜(金币+2, EPI+1): 鼓励分享 2011-04-22 19:10:50
西瓜:编辑内容 2011-04-22 19:11
我们使用超级感受态做转化，传给你你可以借鉴一下

        （1）将-70℃保存的E.coli JM109于LB平板上划线，37℃培养过夜。
        （2）挑接单克隆于LB液体试管（5 mL，Amp浓度为100 μg/mL），37℃ 200 rpm培养过夜。
        （3）将上述培养菌液按4%比例转接新鲜的LB液体培养基，37℃，250 rpm培养至OD值约为0.8。
        （4）将菌液立即置于冰上10 min，4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体。
        （5）加1/5原菌液体积的Buffer I，冰浴10 min，4℃，4000 rpm离心10 min。
        （6）完全去上清，按原菌液体积的1/40～1/20加入Buffer II，分装100 μL/1.5 mL离心管（可放置-70℃冰箱保存备用）。

Buffer I: 30 mM KAC；100 mM KCl；10 mM CaCl2·2H2O；50 mM MnCl2；15%甘油；乙酸调pH 5.8，过滤除菌；
Buffer II: 10 mM MOPS；10 mM KCl；75 mM CaCl2·2H2O；15% 甘油；NaOH调pH 6.8，过滤除菌；

[ Last edited by 西瓜 on 2011-4-22 at 19:11 ]
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6楼2011-04-22 16:34:05
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
1949stone(金币+1): 有道理 2011-04-23 10:55:17
引用回帖:
Originally posted by yanying198 at 2011-04-22 16:34:05:
我们使用超级感受态做转化，传给你你可以借鉴一下

其实你可以直接把方法粘到帖子里，更方便些。记得把Buffer配方补上去哦~
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8楼2011-04-22 16:45:20
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yanying198

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励！你上个帖子我编辑了，如有不妥就跟我说哈~ 2011-04-22 19:10:26
呵呵 我给忘记粘了，我也没配置过这两个buffer，所以没留意。
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9楼2011-04-22 18:34:43
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): epi来也 2011-04-22 20:52:02
1、楼主培养细胞的时候转接培养三次，引入受污染隐患。
2、楼主没有试过用氯化镁处理。
3、感受态细胞分装到EP管中的时候，EP管要预冷，分装好之后要放在冰中，一直到放到冰箱里保存都不该升温。
4、感受态保存所用的溶液没有加甘油，细胞放久了会死掉。
5、热激之后放置在冰里并不只是为了冷却，还要等待细胞壁修复。
6、6楼所用的E.coli JM109是不是已经有了质粒，不然为什么能抗Amp？我们不用E.coli JM109作表达菌株，里面是没有西游密码子质粒的，做完了感受态之后要接种到含有Amp的LB中看长不长，如果能长就是感受态制作失败了。不知道6楼实验室是怎么使用E.coli JM109的，我只是奇怪，没有针对6楼的意思。
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风车少年
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
10楼2011-04-22 19:55:45
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