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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急求酿酒酵母的电转感受态制备方法和转化方法
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牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)

[求助] 急求酿酒酵母的电转感受态制备方法和转化方法

急求酿酒酵母的电转感受态制备方法和电转化方法，不胜感激
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1楼 2011-06-30 17:30:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ty1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-07-01 01:52:39
(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30
o
C培养12 h；
(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30
o
C培养8 h，
使菌体达到同步生长状态；
(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min离心5 min收集菌体；
(4)弃上清，加入已预冷的15 mL超纯水洗涤菌体一次；
(5)6,000 r/min离心5 min收集菌体，用15 mL 1 mol/L山梨醇重复洗涤菌体三次；
(6)离心收集菌体，加入200μL 1 mol/L山梨醇重悬浮菌体，取200μL的菌悬液至1.5 mL
离心管中；
(7)在制得的菌悬液中加入20μL(≤5μg)待转化的质粒或DNA片段，轻轻混匀后冰浴
10 min；
(8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500 V电击5 ms；
(9)加入适量体积的1 mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布
相应的抗性平板；
(10)30度培养3-5天挑选转化子。
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2楼2011-06-30 21:28:08
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普通回帖

牵着猎人的狼

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ty1987 at 2011-06-30 21:28:08:
(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30
o
C培养12 h；
(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30
o
C培养8 h，
使菌体达到同步生长状态；
(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后 ...

您做过酵母营养缺陷的筛选么？还有转化酵母的时候质粒用线性化么？
赞一下 回复此楼
3楼2011-07-01 09:40:05
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ty1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

牵着猎人的狼(金币+5): 2011-07-01 23:47:44
引用回帖:
Originally posted by 牵着猎人的狼 at 2011-07-01 09:40:05:
您做过酵母营养缺陷的筛选么？还有转化酵母的时候质粒用线性化么？

缺陷型筛选没做过啊.质粒需不需要线性化根据具体的质粒和你的表达方式而定了，如果你做的是游离表达就不需要线性化，如果做的是整合表达就需要线性化，线性化是选用同源臂上的酶切位点，使质粒呈线性，能够整合到染色体上。
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4楼2011-07-01 10:50:06
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吉林农大

木虫 (小有名气)
顶一下，希望能有用
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我靠
5楼2013-07-06 09:54:56
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冰艺于欣然

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ty1987 at 2011-06-30 21:28:08
(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30
o
C培养12 h；
(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30
o
C培养8 h，
使菌体达到同步生长状态；
(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后， ...

您用1M的山梨醇的时候会出现结晶析出的现象吗？我每次冰浴了之后都会析出来
还有我电转之后涂的平板是尿嘧啶缺陷型的，涂100ul能长不少，然后我挑单菌落再长一次，之后再在液体里长一次，都能长，为什么我菌落、菌液PCR都P不出来，质粒也提不出来呢？
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6楼2014-04-11 19:01:02
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Neo2000

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 冰艺于欣然 at 2014-04-11 19:01:02
您用1M的山梨醇的时候会出现结晶析出的现象吗？我每次冰浴了之后都会析出来
还有我电转之后涂的平板是尿嘧啶缺陷型的，涂100ul能长不少，然后我挑单菌落再长一次，之后再在液体里长一次，都能长，为什么我 ...

貌似PEG/LiAc法效果更好

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7楼2014-04-11 20:15:10
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冰艺于欣然

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-11 20:15:10
貌似PEG/LiAc法效果更好
...

是吗，我下回试一下，谢谢啦
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8楼2014-04-12 10:06:19
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Neo2000

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冰艺于欣然 at 2014-04-12 10:06:19
是吗，我下回试一下，谢谢啦...

我以前也试过电转化，效果远不及PEG法

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-04-12 12:32:07
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TJ-90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-11 20:15:10
貌似PEG/LiAc法效果更好
...

请问能大概下介绍PEG/LiAc法吗？
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10楼2014-12-25 15:53:38
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