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niuniu2010

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 感受态的制备及转化？

这是我制备感受态及转化的流程，近期转化一直不成功，请大家给予指导。转化所用质粒是长期存于-40℃的，不知道影响大不？
（一）DH5a菌感受态的制备：
1、从LB平板上挑取DH5a单菌落,接种于3LB液体培养基中 37℃下振荡培养12h左右直至对数生长后期培养基中。
2、将菌悬液以1:100的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜，再将菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生长对数期），约2-3h
3、将菌液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
4、每只离心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌体重悬，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
5、每只离心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬后分装到无菌的1.5ml离心管中(每管100µl)；
6、置-40℃冰箱长期保存；
（二）DH5a大肠杆菌的热击转化：
⑴ 分别在1管100µl感受态细胞中加入质粒1-2µl和无菌水1-2µl（阴性对照），轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴30min；
⑵ 将离心管放至42℃的循环水浴中90s；
⑶ 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却至室温；
⑷ 每管加800µl LB液体培养基，37℃培养箱中45min；
⑸ 取l转化的感受态细胞，分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻璃棒将菌液涂满整个平板表面；
⑹ 将平板置于超净台中直至平板表面菌液被吸收；
⑺ 封好平皿，倒置于37℃培养，12-16h。

[ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ]

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1楼 2011-04-22 08:47:37

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【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): epi来也 2011-04-22 20:52:02

1、楼主培养细胞的时候转接培养三次，引入受污染隐患。
2、楼主没有试过用氯化镁处理。
3、感受态细胞分装到EP管中的时候，EP管要预冷，分装好之后要放在冰中，一直到放到冰箱里保存都不该升温。
4、感受态保存所用的溶液没有加甘油，细胞放久了会死掉。
5、热激之后放置在冰里并不只是为了冷却，还要等待细胞壁修复。
6、6楼所用的E.coli JM109是不是已经有了质粒，不然为什么能抗Amp？我们不用E.coli JM109作表达菌株，里面是没有西游密码子质粒的，做完了感受态之后要接种到含有Amp的LB中看长不长，如果能长就是感受态制作失败了。不知道6楼实验室是怎么使用E.coli JM109的，我只是奇怪，没有针对6楼的意思。