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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 感受态的制备及转化？
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niuniu2010

铜虫 (初入文坛)

[求助] 感受态的制备及转化？

这是我制备感受态及转化的流程，近期转化一直不成功，请大家给予指导。转化所用质粒是长期存于-40℃的，不知道影响大不？
（一）DH5a菌感受态的制备：
1、从LB平板上挑取DH5a单菌落,接种于3LB液体培养基中 37℃下振荡培养12h左右直至对数生长后期培养基中。
2、将菌悬液以1:100的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜，再将菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生长对数期），约2-3h
3、将菌液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
4、每只离心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌体重悬，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；
5、每只离心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬后分装到无菌的1.5ml离心管中(每管100µl)；
6、置-40℃冰箱长期保存；
（二）DH5a大肠杆菌的热击转化：
⑴ 分别在1管100µl感受态细胞中加入质粒1-2µl和无菌水1-2µl（阴性对照），轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴30min；
⑵ 将离心管放至42℃的循环水浴中90s；
⑶ 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却至室温；
⑷ 每管加800µl LB液体培养基，37℃培养箱中45min；
⑸ 取l转化的感受态细胞，分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻璃棒将菌液涂满整个平板表面；
⑹ 将平板置于超净台中直至平板表面菌液被吸收；
⑺ 封好平皿，倒置于37℃培养，12-16h。

[ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ]
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1楼 2011-04-22 08:47:37
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-22 20:51:40
呵呵，我们也是使用超级感受态，转化效率高多了。
那个方法没问题。就是可能还是不够低温吧。都不好说。呵呵
赞一下(2人) 回复此楼
最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
7楼2011-04-22 16:35:57
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 应助回帖哦 2011-04-22 13:56:02
没看出有什么问题呀。注意的就是冰箱长期长期保存后转化效率会明显降低。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-04-22 10:43:15
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-22 13:56:15
niuniu2010(金币+1): 2011-04-22 15:27:59
你的流程没什么问题，是标准的转化流程。
你需要注意的是，如果感受态细胞要长期保存的话，最好分装后液氮速冻，然后置于-80度，基本上可以使用一年。
你转化不出的原因可能出在质粒上，如果你的质粒浓度不高又在-40保存时间过长的话，建议在转化过程中可以稍微多加一点。
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3楼2011-04-22 13:12:01
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-22 16:02:52
我实验室做感受态用到了PIPES，效率蛮高的。楼主查查这个，网上一搜很多。
赞一下(1人) 回复此楼
仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2011-04-22 13:43:12
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