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yabing0324

金虫 (职业作家)

[交流] 【求助】感受态细胞制备

大家好！
我在震荡培养至OD600到0.5，后，分装到4个50ml离心管中，按照步骤要冰上放置10分钟，然后离心收集菌体，但是，由于离心机出了点问题，耽误了四十分钟，就是说在冰上放置了将近一个小时，才离心的，呜哇哇，不知道影响大吗？

[ Last edited by rainwander on 2011-1-6 at 17:40 ]
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1楼2011-01-06 16:28:26
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susizheng

木虫 (著名写手)
yabing0324(金币+3):又快又好！ 2011-01-06 16:39:08
冰上放置时间越长越好。
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2楼2011-01-06 16:30:14
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
rainwander(金币+2):恩，多少会有一点点影响的，问题应该不大~~~ 2011-01-06 17:41:47
yabing0324(金币+1): 2011-01-06 21:59:23
引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-01-06 16:28:26:
大家好！
我在震荡培养至OD600到0.5，后，分装到4个50ml离心管中，按照步骤要冰上放置10分钟，然后离心收集菌体，但是，由于离心机出了点问题，耽误了四十分钟，就是说在冰上放置了将近一个小时，才离心的，呜哇 ...

一般要求冰上放置30min，但是楼上说“冰上放置时间越长越好”令人费解，若冰上放置1h应该也没有什么问题，具体有没有影响可以做个试验对照一下看看，我觉得只是在冰上放置的过程中菌体仍在生长增值，OD值会变大一点点！
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3楼2011-01-06 17:25:59
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2011-01-06 21:20:58
yabing0324(金币+1): 2011-01-06 21:59:31
嗯 嗯，40分钟问题不大，有文献报道化转法，冰上放置6h效果最好，呵呵，不知道你用的是什么转化方法，离心机出问题，记得先预冷，不然影响很大哦
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4楼2011-01-06 18:29:57
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zmw_520

禁虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2011-01-06 21:21:14
本帖内容被屏蔽
5楼2011-01-06 18:46:17
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yabing0324

金虫 (职业作家)
★
翱宇(金币+1):你的这些基本上很详细了，我给你个补充的建议是分装后，放于液氮速冻后再保持至负70度 2011-01-06 22:02:48
引用回帖:
Originally posted by 最爱花诗雨 at 2011-01-06 18:29:57:
嗯 嗯，40分钟问题不大，有文献报道化转法，冰上放置6h效果最好，呵呵，不知道你用的是什么转化方法，离心机出问题，记得先预冷，不然影响很大哦

用CaCl2 的方法
先冰上放置10分钟，4度离心，收集菌体，加冰冷氯化钙悬浮，再4度离心，加含15%甘油的氯化钙，冰上放置8分钟，分装
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6楼2011-01-06 21:56:22
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by zmw_520 at 2011-01-06 18:46:17:
应该没什么问题，只是想说一般OD600到0.3-0.4，最好是0.3多一点点比较好，你那个0.5有点大了~~~感受态做得好最主要的是0.3那个点111

哦，那我那个估计不好了。。。。。
先用下试一试
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7楼2011-01-06 21:57:11
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by srlee at 2011-01-06 17:25:59:


一般要求冰上放置30min，但是楼上说“冰上放置时间越长越好”令人费解，若冰上放置1h应该也没有什么问题，具体有没有影响可以做个试验对照一下看看，我觉得只是在冰上放置的过程中菌体仍在生长增值，OD值会变 ...

对呀，此话有理，本来我的OD就挺大了，这样该不好了，那么请问怎么才能检测一下我的感受态能用不？
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8楼2011-01-06 21:58:40
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-07 10:09:59
引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-01-06 21:58:40:


对呀，此话有理，本来我的OD就挺大了，这样该不好了，那么请问怎么才能检测一下我的感受态能用不？

感受态做完后检验一下转化效率呀，并做一下对照。其实感受态这东西也就是转化效率高低的问题而已，除非有特殊实验如建文库什么的需要较高要求的感受态（达到10次方），平时实验中一些小转化，实验室里随便做一下就足够用了。
做感受态一般用的是这种方法（Hioraki Inoue, Hiroshi Nojima and Hiroto Okayama, Transformation of  E. coli with plasmids, Gene V.96 (1990), pp. 23-28.）分子克隆上也有，这些都是比较基础的，你自己看看充下电吧！当然，也有许多实验室有自己优化的制备感受态的方法，但大体都差不多。祝实验顺利！
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9楼2011-01-06 22:21:57
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by srlee at 2011-01-06 22:21:57:


感受态做完后检验一下转化效率呀，并做一下对照。其实感受态这东西也就是转化效率高低的问题而已，除非有特殊实验如建文库什么的需要较高要求的感受态（达到10次方），平时实验中一些小转化，实验室里随便做一 ...

非常感谢，我用别人的质粒做了一下，都长出来了，涂了120μL，斑长的比较密集，我今天涂的时候加了60μL连接产物，现在还没出结果呢，我其实就是想把PCR产物连到质粒里去，再用质粒做荧光定量的标准曲线，不建库，只要能长出来，我提质粒就是目的
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10楼2011-01-09 19:47:19
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cnb1987

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
46319楼: Originally posted by yabing0324 at 2011-01-06 21:56:22
用CaCl2 的方法
先冰上放置10分钟，4度离心，收集菌体，加冰冷氯化钙悬浮，再4度离心，加含15%甘油的氯化钙，冰上放置8分钟，分装...

你好，我问一下，15%甘油的氯化钙怎么配？15体积的甘油和85体积的氯化钙么？
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11楼2013-03-09 10:19:53
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