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军歌

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌感受态制备及转化中的问题 已有3人参与

请求各位帮帮忙,本人制作完DH5α感受态以后,做转化,过夜,第二天菌斑长的还可以,但是有大有小,做PCR鉴定,结果什么都没有,我一共做了20个样品,全都是这样,我怀疑是杂菌,但是,如果质粒没有转进去,杂菌在含有抗生素(amp)的平板上是不会长的呀。会不会是载体自连?
另外,是不是涂完板后,只要长出菌斑,感受态就应该没有问题,我现在也不知道到底是我连接的有问题,还是我的感受态有问题
多谢各位能给与帮助
谢谢
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军歌

新虫 (初入文坛)

太感谢你们了,我按你们的方法试试,
谢谢
4楼2010-08-25 13:44:54
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
呵呵,好多杂菌都是基因组自带抗性的

有可能是你的感受态里边有杂菌,或者你的操作有点问题

amp会出一个微星菌落的问题,所以应该挑大斑

另外,如果抗生素效价低的话也肯能,但抗生素失效往往都是成片的没有单克隆,出单克隆的概率很低

所以基本可以断定是污染了杂菌

关于感受态,有菌只能说明他们没有死,不能反应效率,这个需要转化一个环形质粒做阳性对照

同时你也应该用未转化的感受态去做一个阴性对照,这样判断是不是感受态污染,是不是操作问题,是不是抗生素问题

所以你的问题做两个对照就解决了
2楼2010-08-25 10:22:15
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oyanxuelai

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
哈哈,你可以设计两组对照,一组阳性对照,用标准的质粒进行转化;一组阴性对照,不加任何DNA.一般情况下,阳性对照菌落长得很多,阴性对照不长菌.如果阴性对照长了,说明感受态受污染,有杂菌存在.
3楼2010-08-25 13:19:57
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