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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】大肠杆菌菌液，如何再扩增？
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lwfangel

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌菌液，如何再扩增？已有5人参与

用大肠杆菌做克隆，挑好白色单菌落之后，放到1mlAmp抗性的LB培养基中，摇菌，浑浊后做菌液PCR。对于有克隆产物的菌液，我怎样才能得到更多的菌液呢？

我想将有克隆产物的菌液吸取10ul，加到1mlAmp抗性的LB培养基中，摇菌，这样做是否合理？我这样做了之后，再做PCR去没有产物条带，不知道是什么原因？

还有我做的菌液PCR在第二次，点样跑胶时，去没有条带了，又是怎么回事？菌液PCR产物很不稳定吗？
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1楼2010-12-06 14:06:57
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+3):谢谢参与解答。菌液做PCR很容易产生假阳性的。 2010-12-06 16:37:45
在无污染的情况下是可以用菌液继续培养的
保险起见还是先用菌液划线或者稀释之后涂板子挑单克隆再摇
菌落PCR一般都是假阳性多，假阴性很少见到。是不是菌沉下去了，吸上清里没多少菌所以P不出来？
PCR产物不应该那么容易降解啊，再跑一次胶就没有了？
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2楼2010-12-06 14:14:10
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lwfangel

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-06 14:14:10:
在无污染的情况下是可以用菌液继续培养的
保险起见还是先用菌液划线或者稀释之后涂板子挑单克隆再摇
菌落PCR一般都是假阳性多，假阴性很少见到。是不是菌沉下去了，吸上清里没多少菌所以P不出来？
PCR产物不应 ...

我现在觉得是因为污染了，所以菌落PCR不成功。谢谢帮助。
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3楼2010-12-06 16:19:41
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌落PCR筛到阳性后，直接扩大培养提质粒酶切了，再做菌液PCR没什么意义了。
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-12-06 17:09:00
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lwfangel

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-06 17:09:00:
菌落PCR筛到阳性后，直接扩大培养提质粒酶切了，再做菌液PCR没什么意义了。

请问你是怎么扩大培养的？
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5楼2010-12-06 19:07:28
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-08 13:49:23
引用回帖:
Originally posted by lwfangel at 2010-12-06 19:07:28:


请问你是怎么扩大培养的？

直接从摇菌管中1：:10转接至10 mL培养瓶中，提质粒，酶切验证，剩余菌液保种。
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Thank-you，so-blue.
6楼2010-12-06 22:45:44
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lwfangel

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-06 22:45:44:

直接从摇菌管中1：:10转接至10 mL培养瓶中，提质粒，酶切验证，剩余菌液保种。

谢谢，给予回答。
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7楼2010-12-07 12:24:55
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与解答~ 2010-12-07 14:22:58
引用回帖:
Originally posted by lwfangel at 2010-12-07 12:24:55:

谢谢，给予回答。

其实一开始就挑单菌落到三四毫升培养基里摇
摇起来之后，2mL用于提质粒验证，200uL用于冻存保种，剩余的在必要的情况下可以送测序。这样就不用重新扩培了。2mL的菌液提的质粒一般也足够检测以及后续操作
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8楼2010-12-07 13:02:18
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lwfangel

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-07 13:02:18:

其实一开始就挑单菌落到三四毫升培养基里摇
摇起来之后，2mL用于提质粒验证，200uL用于冻存保种，剩余的在必要的情况下可以送测序。这样就不用重新扩培了。2mL的菌液提的质粒一般也足够检测以及后续操作

冻存你是怎么做的？
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9楼2010-12-08 12:53:22
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by lwfangel at 2010-12-08 12:53:22:


冻存你是怎么做的？

加等体积30%甘油，-70冻就是了
其实2mL提的质粒很多了，基本上够用了。实验顺利的话，这个冻存的菌基本上不会再用到了
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10楼2010-12-08 21:51:20
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