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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
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dzwd

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段DNA如何连接载体

4900bp长度 DNA 片段，我用的是TAKARA,PMD19-T载体进行连接，连接数小时，但是在筛选蓝白菌斑的时候，菌落白斑过少，不知道是什么原因，并且菌落PCR后无条带，总是连接不上。。希望能得到解答，谢谢！！
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1楼 2011-08-12 10:45:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
13楼2011-08-12 12:31:35
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追梦草

新虫 (初入文坛)
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。
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19楼2013-08-05 23:18:52
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普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

dzwd(金币+1): 2011-08-13 22:48:56
楼主的DNA片段浓度太小吧！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-12 10:48:20
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！7K多，不错嘛！ 2011-08-12 18:17:36
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-12 10:50:20
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢
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4楼2011-08-12 10:51:54
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

您是说我的平板要培养时间长一些是么，我是培养14个小时，那您认为大概多久为好呢，谢谢
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5楼2011-08-12 10:53:49
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 10:51:54:
你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢

我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。
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jiayoubashaonian
6楼2011-08-12 10:54:11
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:48:20:
楼主的DNA片段浓度太小吧！

不好意思，那您认为多大浓度为好呢，我不是很明白，您能在说清楚一些么
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7楼2011-08-12 10:55:05
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 有道理！ 2011-08-12 18:17:52
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:17
大片段连接就是很难的，但是一直坚持做几天总会成功的。另外菌检的时候尽量扩增片段在2000bp一下，实在扩不出来就挑几个摇菌提质粒酶切验证。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
8楼2011-08-12 10:55:40
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 热心 2011-08-12 18:18:01
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！
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jiayoubashaonian
9楼2011-08-12 10:56:39
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:56:39:
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！

您平板培养大概多少时间，我是14个小时
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10楼2011-08-12 10:59:31
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