应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
221/3返回列表123下一页
查看: 3651  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

dzwd

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段DNA如何连接载体

4900bp长度 DNA 片段，我用的是TAKARA,PMD19-T载体进行连接，连接数小时，但是在筛选蓝白菌斑的时候，菌落白斑过少，不知道是什么原因，并且菌落PCR后无条带，总是连接不上。。希望能得到解答，谢谢！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-08-12 10:45:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！
赞一下(3人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
13楼2011-08-12 12:31:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦草

新虫 (初入文坛)
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2013-08-05 23:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

dzwd(金币+1): 2011-08-13 22:48:56
楼主的DNA片段浓度太小吧！
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2011-08-12 10:48:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！7K多，不错嘛！ 2011-08-12 18:17:36
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！
赞一下(2人) 回复此楼
jiayoubashaonian
3楼2011-08-12 10:50:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢
赞一下 回复此楼
4楼2011-08-12 10:51:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

您是说我的平板要培养时间长一些是么，我是培养14个小时，那您认为大概多久为好呢，谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2011-08-12 10:53:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 10:51:54:
你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢

我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
6楼2011-08-12 10:54:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:48:20:
楼主的DNA片段浓度太小吧！

不好意思，那您认为多大浓度为好呢，我不是很明白，您能在说清楚一些么
赞一下 回复此楼
7楼2011-08-12 10:55:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 有道理！ 2011-08-12 18:17:52
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:17
大片段连接就是很难的，但是一直坚持做几天总会成功的。另外菌检的时候尽量扩增片段在2000bp一下，实在扩不出来就挑几个摇菌提质粒酶切验证。
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
8楼2011-08-12 10:55:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 热心 2011-08-12 18:18:01
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
9楼2011-08-12 10:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:56:39:
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！

您平板培养大概多少时间，我是14个小时
赞一下 回复此楼
10楼2011-08-12 10:59:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 学员x4ipC2 的主题更新
221/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +9 且听虎啸 2026-08-07 12/600 2026-08-07 21:53 by 理想三旬2025
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +4 哈哈114477 2026-08-01 4/200 2026-08-07 14:39 by jgy194592
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +4 yang182083 2026-08-06 6/300 2026-08-07 12:43 by 虫友是什么虫
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭