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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
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dzwd

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段DNA如何连接载体

4900bp长度 DNA 片段，我用的是TAKARA,PMD19-T载体进行连接，连接数小时，但是在筛选蓝白菌斑的时候，菌落白斑过少，不知道是什么原因，并且菌落PCR后无条带，总是连接不上。。希望能得到解答，谢谢！！
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1楼2011-08-12 10:45:43
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

dzwd(金币+1): 2011-08-13 22:48:56
楼主的DNA片段浓度太小吧！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-12 10:48:20
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！7K多，不错嘛！ 2011-08-12 18:17:36
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-12 10:50:20
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 10:51:54:
你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢

我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。
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jiayoubashaonian
6楼2011-08-12 10:54:11
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 热心 2011-08-12 18:18:01
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！
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jiayoubashaonian
9楼2011-08-12 10:56:39
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-08-12 18:18:19
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！
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jiayoubashaonian
11楼2011-08-12 11:01:58
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 14:00:31:
您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试

用的TRANS T1 blunt ， 钝末端，感受态Trans T1， 好像感受态是随着送一包！楼主可以咨询一下，这段时间一直在做生理实验，不知他们那里是否有所变动？
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jiayoubashaonian
16楼2011-08-12 14:33:58
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