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笔冰河

银虫 (小有名气)

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[求助] 目的片段与表达载体的连接

1kb的目的片段与PET-19b连接，转化DH5a，平板培养16小时无菌落。做了空载体转化的对照，14小时平板菌落长得很好，也就是问题出在连接，怎么优化连接呢，有什么需要注意的？
PS: 连接体系 14μl 目的片段，3μl 酶切载体，2μl buffer，1μl T4连接酶。（带有目的片段的T载体和PET载体都是用试剂盒提，使用相同的酶切体系）

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1楼2011-11-02 10:48:22

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taocheng82

铜虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+5): Good！热心！专业！ whs 2011-11-4 2011-11-04 13:02:19
西瓜(金币+1, MolEPI+1): 很用心解答哦，经验很丰富！ 2011-11-05 22:01:48

这个问题对于新手或者不顺利的情况下比较常见，常见的解决方案如下
1,确定感受态效率没有问题，你的空白对照虽然长出来了，但是可能是质粒或者单酶切的连接产物，他们的转化比较容易长出来，确定的方法是看看同实验的其他人用一样的感受态做连接有没有做出来，如果有，排除，如果没有，重新做感受态细胞！
2. 连接酶的效率低或者是失活，缺的方法同上，问一下其他同学同统一管连接酶的结果；
3，如果排除了上面的原因，就是载体和片段的问题，这个问题的解决方案非常简单，你把两个载体和片段重新做一遍，注意载体酶切的时间要够，量不要加多了，一般1ug就够用了！载体如果是PCR产物，则酶切的时候不能加入太多，另外要注意保护碱基的问题，重新做过后定量按照1-3-1:10的原则添加，载体一般如果量多的话加入50ng左右基本就够了，当时200ng都是可以的，再高了就不用加了，一般自己做的载体的话浓度都不会很高，可以方面加入！体系一般使用10ul，如果你的感受态是200ul体系的话加20ul也是可以的！
4. 如果上面的都重复过了，那么就要看一下平板的抗生素是不是加多或者时间放旧了，培养基LB是不是有为问题？培养箱和摇床的温度和转速问题是不是合理？涂布平板的时候的涂抹棒是不是温度太高了？
5. 如果上面都排出了，还是做不出来，建议你去附近的庙里烧柱香，过个几天再把所有东西用新的重新来过，基本上只要是不是RP特差应该都能做出来的！
好久不发帖，好久不涉猎这些问题了，小发几句牢骚！
PS.