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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建的相关问题
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建的相关问题

现在要构建表达载体，有一些问题不是很明确，希望懂得的不吝赐教啊！
首先是双酶切表达载体和带有目的片段的T载体，一般都切多少时间啊？我看有说切过夜的，也有切几个小时的！切完以后大家都从哪些方面确定酶切完全不完全呢？
其次是连接以后除了直接转化以外，还有什么方法确定是否连接上了呢？
本人新手一个，对于这方面不是很了解，希望各位帮帮忙！
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1楼 2011-07-18 15:05:41
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
friya0910(金币+2): 2011-07-18 15:25:29
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-18 16:32:08
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:50
如果你的片段大的话就过夜切吧，我一般都是过夜切，用fermentas的酶。如果不过夜切的话，中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否，你可以做一下菌落pcr，p一下你的目的条带。好好做，加油！
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
2楼2011-07-18 15:18:40
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-18 15:18:40:
如果你的片段大的话就过夜切吧，我一般都是过夜切，用fermentas的酶。如果不过夜切的话，中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否，你可以做一下菌落pcr，p一下你的目的条带。好好做，加油！

菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽，看来没有什么捷径啊！我的片段不大，才300bp，“中间隔4-5个小时”是什么意思啊？
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3楼2011-07-18 15:27:39
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-18 16:32:39
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:57
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-18 15:27:39:
菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽，看来没有什么捷径啊！我的片段不大，才300bp，“中间隔4-5个小时”是什么意思啊？

就是酶切时间4或5个小时啦，你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
4楼2011-07-18 15:36:51
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-18 15:36:51:
就是酶切时间4或5个小时啦，你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊？

片段小就不能做连接吗？有这么一说么？
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5楼2011-07-18 15:44:30
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-18 15:44:30:
片段小就不能做连接吗？有这么一说么？

我没说片段小就不能做连接啊，看来我们沟通有障碍，哈哈，你说你做用转化液做转化那几句我没看懂。做转化不都是这样的嘛，我以为你不按常规走呢
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
6楼2011-07-18 17:03:37
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千king寻

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!金属浴没听说过，孤陋寡闻了……连接时我们一般放15度培养箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金币+5): 2011-07-20 17:59:26
双酶切37度水浴2——3个小时，之后琼脂糖凝胶电泳观察条带，若条带正确则切胶回收，此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接，若用T4连接酶，则需16度金属浴过夜连接，之后进行转化、培养皿过夜培养，挑取3个左右生长良好、单个的菌落于5毫升左右的培养液中37度摇床培养6个小时，进行PCR鉴定是否成功，若电泳观察条带正确则抽质粒，即为连到载体且含有酶切位点的质粒，也可再次进行双酶切鉴定。
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7楼2011-07-20 14:04:28
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金币+1): 2011-07-20 17:59:31
看一下这两个帖子吧http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329
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8楼2011-07-20 14:40:29
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 我也很好奇 2011-07-21 11:22:52
引用回帖:
Originally posted by 千king寻 at 2011-07-20 14:04:28:
双酶切37度水浴2——3个小时，之后琼脂糖凝胶电泳观察条带，若条带正确则切胶回收，此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接，若用T4连接酶，则需16度金属浴过夜连 ...

金属浴是什么？可以在水浴锅中或者直接在PCR仪上啊
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9楼2011-07-20 21:12:08
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千king寻

铜虫 (初入文坛)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励反馈哦 2011-07-21 11:23:33
　金属浴：采用微电脑控制和半导体制冷技术制造的一款恒温金属浴产品，仪器可配置多种模块，可广泛应用于样品的保存、各种酶的保存和反应、核酸和蛋白质的变性处理、PCR 反应、电泳的预变性和血清凝固等。  
   性能特点：
★微电脑数显控制温度.
★采用先进的热电膜加热技术.
★同时显示设置温度和即时温度.
★采用金属模块，可使样品免受污染.
★金属模块可方便更换，便于清洁、消毒和适用各种试管.
★内置超温保护装置，使用更可靠.
★温度偏差校准。
这是在说明书上写的，具体的我也不是太清楚，我们实验室在进行目的基因连接到载体上时都是在金属浴16度过夜连接的。
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10楼2011-07-21 10:34:11
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